白屈菜红碱对人高转移性肝癌细胞系MHCC97-H生长侵袭和迁移能力的调节作用*

程金玉 赵乐中 李 伟 谢国永

商丘市第三人民医院普外科 (河南 商丘， 476000)

原发性肝癌包括肝细胞癌、肝内胆管细胞癌和肝胆管混合型癌，其中肝细胞癌占90%以上。多数患者确诊时已经属于中晚期或发生远处转移。化疗药物单独或联合使用效率不高，且毒副作用大，可重复性差。应用中医中药能够改善该类患者的症状，提高机体免疫功能，减轻放化疗的不良反应。白屈菜是传统中药材，具有止咳、镇痛、解毒等多种功效。白屈菜红碱是白屈菜中重要活性成分，具有抗炎、抑菌、抗寄生虫等多种药理活性[1,2]。近年来研究发现，白屈菜红碱对多种肿瘤细胞系有抑制作用，如鳞状细胞癌、结肠癌、黑色素瘤、神经瘤等[3]。笔者以体外培养的肝癌细胞MHCC97-H为研究对象，探讨白屈菜红碱对其生长、侵袭和迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 白屈菜红碱(纯度>98%，CAS：34316-15-9)购自成都瑞芬思生物科技有限公司；胎牛血清和DMEM培养基购自美国Gibco公司；胰酶购自Hyclone公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁公司；Ki67、VEGF、MMP-9抗体购自美国Cell Signalling Technology公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肝癌细胞MHCC97-H的培养 MHCC97-H细胞接种于DMEM培养基(含10%胎牛血清)，培养条件为37℃、5%CO2的恒温恒湿培养箱。细胞每隔1 d更换新鲜培养基，传代时使用0.25%胰蛋白酶消化。取对数生长期的细胞进行实验。白屈菜红碱溶解于灭菌水后，用0.22 μm针头滤器过滤。

1.2.2 CCK-8检测药物毒性和细胞增殖 取对数生长期的MHCC97-H细胞，胰酶消化后，调整细胞浓度至8×104个/ml，取100 μl细胞悬液至96孔板，正常条件下预培养6 h。待细胞贴壁后分别加入10 μl相应浓度的白屈菜红碱，并设置空白对照组，每组设置3个复孔，培养24 h后加入10 μl CCK-8溶液，继续培养2 h后检测450 nm处光吸收值，细胞存活率=(加药-空白)/(对照-空白)×100%。

取对数生长期的MHCC97-H细胞，胰酶消化后，调整细胞浓度至4×104个/ml，取100 μl细胞悬液至96孔板，正常条件下预培养6 h待细胞贴壁。MHCC97-H细胞贴壁后，将细胞分为MHCC97-H组、白屈菜红碱低浓度组(10μmol/L，简称低浓度组)、白屈菜红碱中浓度组(20 μmol/L，简称中浓度组),白屈菜红碱高浓度组(50 μmol/L，简称高浓度组),分别使用含0.10、20、50 μmol/L白屈菜红碱的培养基培养细胞，并设置空白对照组，分别于培养24、48、72、96 h后，加入10 μl CCK-8溶液继续培养2 h，酶标检测仪检测450 nm处光吸收值。

1.2.3 体外侵袭实验 Matrigel用无血清培养基稀释后，取200 μl至Transwell上室，4℃风干。取对数生长期的MHCC97-H细胞，0.25%胰酶消化后，调整细胞密度为1×105个/ml，取200 μl细胞悬液接种于Matrigel包被的Transwell上层小室，下层小室加入含10%胎牛血清的完全培养基。在37℃、5% CO2的培养箱中培养24 h后取出小室，用棉签擦去上层基质和细胞。4%多聚甲醛固定15 min，在滤膜上加几滴吉姆萨染液，反应10 min，蒸馏水洗后，倒置显微镜下随机选择5个400倍视野观察计数并拍照，每组实验重复3次。

1.2.4 划痕实验 实验前用记号笔于培养板背面划平行的5条直线，灭菌后备用。将细胞传代培养于12孔板中，加入不同剂量的药物后，用10 μl枪头沿培养板背面直线垂直划痕。用预冷的PBS洗涤3次后，加入无血清培养液(含10 μg/ml的丝裂霉素C)进行培养，于0、 24 h进行拍照记录，并计算划痕闭合率，划痕闭合率 =(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度。

1.2.5 蛋白质印迹实验 收集不同浓度白屈菜红碱作用24 h后的MHCC97-H细胞，用加蛋白酶抑制剂的裂解液冰上超声裂解，4℃下12000 rpm离心30 min后取上清液，BCA法测定蛋白浓度。各组样品上样量为30 μg，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至PVDF膜；用含5%脱脂牛奶的封闭液室温下封闭1 h，加一抗4℃孵育过夜；TBST洗3次，每次10 min；加二抗，室温下孵育2 h，TBST洗膜后显影，Image J软件分析条带灰度值。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0统计软件对数据进行分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白屈菜红碱毒性检测 以含有一系列浓度白屈菜红碱的培养基培养MHCC97-H细胞24 h后，检测MHCC97-H细胞的存活率。结果显示，浓度小于50 μmol/L时白屈菜红碱对MHCC97-H细胞存活率没有显著影响；浓度大于100 μmol/L时白屈菜红碱能明显降低MHCC97-H细胞的存活率，见图1。本实验选择白屈菜红碱浓度小于50 μmol/L的3个梯度进行后续实验。

图1 不同浓度白屈菜红碱的细胞毒性图

2.2 4组细胞增殖情况 检测1、2、3、4天细胞的增殖。结果显示，与MHCC97-H组相比，低、中、高浓度组细胞增殖倍数明显降低(P均<0.05)，随着白屈菜红碱浓度和作用时间的增加，效果越明显。见图2。

2.3 4组细胞的侵袭能力 与MHCC97-H组相比，低浓度组侵袭细胞数目没有明显变化；而中、高浓度组细胞侵袭的细胞数目明显降低(P<0.05)，且随着白屈菜红碱浓度的增加，效果越明显。见图3。

图2 4组细胞增殖图

图3 4组细胞的细胞侵袭图

图4 4组细胞的细胞迁移图

2.4 4组细胞的细胞迁移情况 结果显示，与MHCC97-H组相比，低、中、高浓度组细胞划痕闭合率明显降低(P<0.05)，且白屈菜红碱浓度越高，效果越明显，见图4。

2.5 4组细胞增殖、迁移相关蛋白表达情况 低浓度组细胞与MHCC97-H组相比，Ki67和MMP-9的表达明显降低，VEGF的表达没有明显变化；与MHCC97-H组相比，中、高浓度组细胞的Ki67、VEGF、MMP-9表达显著降低；且随着白屈菜红碱浓度的增加，变化越明显(P<0.05)，见图5。

图5 4组细胞的增殖、迁移蛋白电泳及表达量图

3 讨论

随着检测和治疗技术的发展，肝癌的诊断和治疗取得较大进步。由于肝癌早期症状不明显，绝大多数患者确诊时属于晚期。目前靶向治疗药物应用范围较小，放疗和消融治疗后容易出现复发和耐药性，使中晚期肝癌整体治疗效果仍不容乐观，患者5年生存率较低[4]。肝癌细胞系MHCC97-H由上海医科大学中山医院建立，肺转移率为100%。肝癌患者出现肺转移后，治疗手段较为有限，且生存率低。Gao 等研究发现，白屈菜红碱能诱导对顺铂耐药的肺癌A549细胞凋亡，对肺癌细胞株H1299、H460、非耐药A549细胞凋亡没有影响[5]。

无限增殖是肿瘤细胞重要特征之一。Zhang等发现，白屈菜红碱抑制人胃癌细胞BGC-823生长，诱导细胞发生凋亡[6]。本研究结果提示白屈菜红碱能够抑制人肝癌细胞MHCC97-H的增殖。

侵袭和迁移是恶性肿瘤的重要生物学特征，在临床上肿瘤细胞发生转移是其难以治愈的重要原因。肿瘤转移是多步骤、多阶段的综合过程，一般包括脱落、转移、着床和转移灶血管形成，因此肿瘤转移能力的抑制是肿瘤治疗中的重要任务[7]。MMP-9是重要的基质金属蛋白酶，能特异性的降解基底膜中的主要成分IV型胶原，与肿瘤细胞的转移密切相关[8,9]。血管内皮生长因子VEGF是高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，能改变血管通透性，促进肿瘤血管生成，从而促使肿瘤发生侵袭和迁移[10,11]。本研究结果提示白屈菜红碱具有抑制肝癌细胞MHCC97-H的侵袭和迁移的能力。

白屈菜红碱属于苯丙菲啶类碱，与蛋白激酶C的催化区直接结合，抑制蛋白激酶C的活性[5]。蛋白激酶C是存在于细胞质的磷脂依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞内信号传递的重要介质[12]。在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和肿瘤耐药性[13]。VEGF与其受体结合后，磷酸化下游磷脂酰肌醇-3-羟激酶等，进而发挥相应作用[14]。蛋白激酶C在VEGF下游蛋白的磷酸化过程中发挥重要作用，当蛋白激酶C被抑制后，VEGF的作用被减弱[15]。白屈菜红碱对蛋白激酶C的抑制作用或许是其影响MHCC97-H增殖、侵袭和迁移的重要因素，但其中的分子学机制需要进一步实验去验证。