侵染‘舞美’苹果的苹果锈果类病毒检测与全序列分析

刘洪玉 孙子豪 李保华 王彩霞

摘要 2017年9月，在山东胶州调查苹果病毒病时发现‘舞美果实表现出明显的花脸症状，取发病树体芽组织嫁接于健康‘富士蘋果幼树上，采用RT-PCR技术对其是否含有苹果锈果类病毒进行了检测，并利用DNAMAN、MEGA 5.1等软件对其全序列进行了分析。结果表明，显症‘舞美果实、发病树体枝条及嫁接‘富士枝条中均可检测出ASSVd，无症状‘舞美果实和相应树体枝条中均未检测到ASSVd。‘舞美分离物基因组主流序列为333 nt （登录号MG745387），与GenBank中已报道的ASSVd序列一致性为92%～99%。序列多重比对及系统进化树分析发现，该分离物的末端保守区和中央保守区与ASSVd参考序列一致，且与不同来源的ASSVd分离物亲缘关系较近。这是首次在‘舞美苹果上发现和鉴定出苹果锈果类病毒。

关键词 苹果锈果类病毒; ‘舞美; RT-PCR; 序列分析

中图分类号： S 432.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018233

苹果锈果病在辽宁[1]、新疆[2]、山东[3]、河北[4]等苹果主产区均有发生，近年来呈不断蔓延趋势，已成为制约我国苹果产业健康发展的主要限制因子。该病的病原为苹果锈果类病毒Apple scar skin viroid （ASSVd），属于马铃薯纺锤块茎类病毒科Pospiviroidae苹果锈果类病毒属Apscarviroid[5]。ASSVd基因组为单链环状RNA，约330个核苷酸，存在于细胞核内，具有自我复制能力，可形成稳定的棒状二级结构，具有一个中央保守区（CCR）和一个末端保守区（TCR）[6]。苹果锈果类病毒除侵染苹果外，还可危害梨[7]、桃[8]、杏[9]等，在果实表面产生锈状斑、花脸、畸形等症状，导致果实丧失商品价值，造成严重经济损失[4]。ASSVd主要通过嫁接、带病毒苗木等传播，尚未发现其昆虫传播介体[10]。因此，繁育和应用无病毒苗木是生产中防治木本植物病毒病害的最有效措施。

目前，苹果锈果类病毒的检测方法主要为生物学症状观察和分子生物学检测技术[4]。ASSVd属于非潜隐性病毒，但发病症状仅表现在果实上，且常由于环境条件、品种等因素影响，导致发病症状差异较大。由于生物学鉴定周期长，等症状出现，已经造成无法挽回的损失[4，11]。分子生物学方法主要包括常规RT-PCR、实时定量PCR、斑点杂交等[4， 1011]，这些方法具有检测灵敏度高、特异性强、快速等优点，且适用于大批量样品的检测，在田间病害的早期诊断及无病毒种苗繁育中得到广泛应用。

芭蕾苹果（ballerina apple）又称柱型苹果（columnar apple），是20世纪90年代从英国引进的新优苹果品种，其中包括一些观赏型品种，如‘舞美 （Maypole）[12]。该品种由威塞克自然杂交实生苗中选出，花冠为艳丽的胭脂红色，花期长，极具观赏价值; 果实圆形或圆锥形，单果重约35 g，大小整齐，成熟时着全面橙红色，鲜艳美观，而且果实可用来加工果酱、果汁和果茶等，用途非常广泛。2017年9月份，在山东胶州果园调查苹果病毒病时发现部分‘舞美果实表现出明显的花脸症状，采集发病果实及发病树体1～2年生枝条，取芽组织嫁接在青岛农业大学试验田健康‘富士苹果幼树上，提取样品总RNA进行RT-PCR检测和测序分析，均证实‘舞美被苹果锈果类病毒所侵染，这是首次在该苹果品种上发现和鉴定ASSVd。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料：2017年9月，在山东胶州商业苹果园中采集表现花脸症状的‘舞美果实和发病树体的1～2年生枝条，取芽组织嫁接在青岛农业大学试验田健康‘富士苹果（无毒苗栽植，且嫁接前进行了ASSVd检测）幼树上。RT-PCR所用阴性对照为健康组培苗，阳性对照为本实验室嫁接保存的带毒‘富士幼树。

菌株与试剂：植物柱式总RNA抽提纯化试剂盒和氨苄青霉素购自生工生物工程（上海）股份有限公司; Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒、Prime STAR Max DNA Polymerase、pMD 18-T克隆载体购自TaKaRa（大连）有限公司; DNA凝胶回收试剂盒、DNA Marker购自擎科梓熙（青岛）生物公司; 大肠杆菌菌株DH5α由本实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA第一链合成

取0.2 g果皮和枝条皮层组织，用液氮研磨后参照植物柱式总RNA抽提纯化试剂盒说明书提取总RNA，其浓度和质量通过P330超微量分光光度计（德国Implen公司）检测后保存于-80℃备用。cDNA第一链的合成参照Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒说明书，以1 μg总RNA为模板，Oligo （dT）18为引物，反转录成cDNA，保存于-20℃备用。

1.2.2 RT-PCR检测

参照赵英和牛建新[3]的报道合成ASSVd的检测引物，ASSVd-dete-F： 5′-CAGCACCACAGGAA-CCTCACGG-3′; ASSVd-dete-R： 5′-CTCGTCGT-CGACGAAGG-3′。以合成的cDNA为模板进行PCR扩增。25 μL扩增体系包括： 12.5 μL 2×Prime STAR Max DNA Polymerase，正向和反向引物各0.5 μL，模板cDNA 1.0 μL，ddH2O 10.5 μL。反应程序为： 95℃预变性3 min; 95℃变性10 s，58℃退火15 s，72℃延伸4 s，35个循环; 72℃延伸5 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.3 ASSVd的全长克隆

根据朱慧[13]的报道合成ASSVd的全长引物，ASSVd-full-F：5′-GACGAAGGCCGGTGAGAAAG-3′;ASSVd-full-R：5′-GACGACGACAGGTGAGTTCC-3′。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用DNA凝胶回收试剂盒进行目的片段的回收纯化，并与载体pMD 18-T连接，热击转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆提取质粒，送交青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。

1.2.4 序列分析及系统进化树构建

将ASSVd全长序列通过NCBI数据库（http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的BLAST进行同源性比对，选择具有代表性序列利用DNAMAN进行多重比对分析。运用MEGA 5.1软件的邻接法（neighbor-joining，NJ），重复次数为1 000，构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 ASSVd的RT-PCR检测

以表现花脸症状‘舞美果实（图1a）和其他样品cDNA为模板，利用ASSVd检测引物进行PCR扩增。图1b结果显示，显症‘舞美果实和发病树体枝条中均可扩增到约300 bp的特异性条带，与ASSVd阳性对照样品的目标条带大小一致; 无症状‘舞美果实和相应树体枝条及健康组培苗中均未扩增到该条带。将发病树体芽组织嫁接于健康‘富士幼树，2018年4月份进行RT-PCR检测，均可扩增到上述特异性条带（图略），表明显症‘舞美苹果确实被ASSVd侵染。

2.2 ASSVd序列测定与多重比对分析

利用全长ASSVd引物进行扩增，PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体，对6个单克隆进行测序。结果表明，所得序列全长为331～333 bp，与GenBank中已报道的ASSVd基因组核苷酸序列一致性为92%～99%。所测序的6条ASSVd序列中，有4条序列完全一致，作为侵染‘舞美苹果的主流序列提交GenBank（序列号MG745387），另外两条序列缺少1～2个碱基。

将测序的主流序列（MG745387）與北京分离物（HQ840722.1）和山东分离物（MH013320）及标准ASSVd（NC_001340.1）序列进行多重比对分析，结果（图2）显示，4个ASSVd序列一致性达96%，在苹果锈果类病毒属的末端保守区（TCR）及中央保守区（CCR）内，仅北京分离物在第17个核苷酸位点有T-C突变。变异位点主要集中在第38位—第50位的左末端区（TLR）交界处，及第251位—第279位的致病区（P区）。侵染‘舞美的ASSVd序列在第49位、第253和254位，分别特异性插入T、A和G碱基。

2.3 ASSVd系统进化树分析

利用NCBI的BLASTn进行同源性搜索，选取10个来自不同国家和地区的ASSVd序列，采用MEGA 5.1软件构建系统发育树，1 000次循环计算系统发育树中节点的自举置信水平。由图3可知，侵染‘舞美分离物ASSVd序列与新疆分离物（KC110860.1）聚在一个分支，说明其亲缘关系较近，且与ASSVd标准菌株聚在一个大分支中。与北京分离物（HQ840722.1）和山东分离物（MH013320）聚在不同的分支，说明其亲缘关系相对较远。

3 讨论

近年来，苹果锈果类病毒病在我国的发生率逐年提高，已成为苹果产业健康发展的限制性因子，引起了有关研究者的高度重视[1011， 1415]。课题组对山东苹果产区病毒病发生情况进行调查时发现，胶州新建幼树园中的部分‘舞美果实表现出典型的花脸症状。本研究利用RT-PCR技术对‘舞美果实和枝条进行了ASSVd检测，研究发现，显症‘舞美果实和相应发病树体枝条中均可检测到ASSVd，而未显症果实和相应树体枝条中没有ASSVd特异性条带，表明RT-PCR检测结果与发病表型症状相一致。9月份将ASSVd检测阳性的枝条，芽接于健康‘富士幼树，第二年4月份，在嫩梢中可检测到ASSVd，进一步证实‘舞美受到ASSVd的侵染。这是首次在‘舞美苹果上发现并检测到ASSVd。

通过对‘舞美分离物进行克隆和序列分析发现，其基因组主流序列由333个核苷酸组成，具有苹果锈果类病毒属中央保守结构序列和末端保守区。该分离物序列与新疆分离物（KC110860.1）一致性最高达99%，而与北京分离物（HQ840722.1）和山东分离物（MH013320）一致性不足95%; 系统进化树分析结果显示，‘舞美与新疆分离物（KC110860.1）聚在一个分支，说明其亲缘关系较近，而与北京分离物（HQ840722.1）和山东分离物（MH013320）聚在不同的分支，表明其亲缘关系相对较远。

芭蕾苹果‘舞美具有重要的观赏价值，且果实能够深加工，近年来推广种植面积不断增加[12]。ASSVd侵染‘舞美后引起果实表面着色不均，产生明显的花脸症状，严重降低了其观赏性和经济价值，并且可能成为类病毒的传播源头，给其他栽培品种造成无法挽回的经济损失。课题组将进一步调查ASSVd在山东及我国其他苹果产区的发生情况，为及时采取措施有效控制苹果锈果病的发生与危害提供科学依据。

参考文献

[1] 郭瑞，李世访，董雅凤，等.苹果锈果类病毒辽宁分离物的克隆与序列分析[J].植物病理学报，2005，35（5）：472474.

[2] 马伟，姜冬梅，陈丽芳，等.苹果锈果类病毒山东栖霞分离物的分子鉴定及序列分析[J].植物保护，2011，37（2）：9194.

[3] 赵英，牛建新.苹果锈果类病毒新疆分离物的克隆和序列分析[J].果树学报，2006，23（6）：896898.