多花黄精内生贝莱斯芽胞杆菌的分离鉴定及其抗菌与促生作用分析

迟惠荣 张亚惠 曾欣 陈卫良 毛碧增

摘要 为鉴定药用植物内生菌的种类，采用稀释涂布平板法从多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua的根、茎、叶内分离出11株内生菌菌株，经平板对峙法筛选出对尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum具有拮抗作用的菌株ZJU-3。经形态学、生理生化鉴定及16S rDNA 序列分析，初步确定该菌株为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析，发现该菌株能产生表面活性素（surfactin）、泛革素（fengycin）和伊枯草菌素（iturin）三类脂肽类化合物。利用盐酸沉淀和甲醇抽提法获得了菌株ZJU-3发酵液中脂肽粗提物。该脂肽粗提物可明显抑制尖孢镰刀菌菌丝的生长，抑制率达到 51.6%。经液相色谱质谱联用（LC-MS）分析表明菌株ZJU-3可产生吲哚乙酸、激动素、玉米素、赤霉素等多种植物激素。温室栽培试验结果发现该菌株对多花黄精具有显著的促生效果，根长和单株根数明显高于对照组。本研究可为进一步应用该菌株提供理论依据。

关键词 多花黄精; 贝莱斯芽胞杆菌; 内生菌; 鉴定; 抗菌活性; 促生

中图分类号： S 476

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018337

Hallmann[1]首次完整地将植物内生菌（endophyte）定义为能够在健康植物活组织内生存而不引起明显寄主植物病变的一大类微生物，主要包括细菌、真菌和放线菌，其中内生细菌主要包括芽胞杆菌属Bacillus、假单胞杆菌属Pseudomonas、肠杆菌属Enterobacter和土壤杆菌属Agrobacterium等[2]。人们对植物内生菌的研究主要涉及内生菌的生物学作用，如可促进宿主植物的生长，促进植株对营养元素的吸收[35]、可产生抗菌物质抑制病原菌生长[6]、诱导植物自身产生系统抗性等[67]。

多花黄精为百合科黄精属植物，被《中国药典》（2015年版）收录[8]，是一味药食同源的中药材。肥厚的地下根茎是多花黄精主要的药用部位， 干燥根茎具有补气养阴、健脾、润肺、益肾等功效。多花黄精主产于湖南、安徽、江西、浙江等地，生产上以根茎繁殖为佳，因其药用价值和营养保健等功能价值不断被人们挖掘，目前黄精原材料处于供不应求的状况。

近年来，随着药用植物的分类、化学药理和栽培方式等方面的深入研究，其内生菌的多样性已成为当今研究的热点。然而，目前仅有少量文献报道黄精内生菌的研究，如李艳玲等[9]报道了泰山黄精的根、茎、叶和果实中分布最广的内生菌类群——镰刀菌属Fusarium sp.，并对其抑菌活性进行了研究。汪滢等[10]报道，浙江多花黄精内生真菌变灰青霉Penicillium canescens可产生3种抗菌物质——乙基氧苯氨基亚胺乙酸、灰黄霉素和呋喃-2-甲基-3-羧甲基-4-羟基-5-甲氧基萘，其对多种植物病原菌具有抑制活性。柏晓辉等[11]从黄山地区健康的野生黄精根茎中分离得到1株内生菌 HJ-1，该菌对绿脓杆菌P.aeruginosa、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhi和苏云金芽胞杆菌B.thuringiensis均具有显著抑菌效果。

本论文主要针对浙江省江山市的多花黄精的内生细菌展开研究，从中分离筛选到一株对尖孢镰刀菌F.oxysporum具有拮抗作用的菌株。在此基础上，开展了该菌株的生理生化和分子鉴定;对其产生的抗菌物质成分和植物激素种类进行了分析，并测定了对尖孢镰刀菌的抗菌作用和对植物的促生作用。

1 材料与方法

1.1 材料

供试植株：多花黄精采自浙江省江山市（28°22′26.97″N，118°30′36.14″E），由浙江省江山市保安乡黄精种植基地提供。

供试菌株：多花黄精病原菌尖孢镰刀菌F.oxysporum保存于浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所。

培养基与试剂：LB、PDA和PDB培养基参照《植病研究方法》[12]配制，分别用于细菌和真菌的培养。细菌基因组提取试剂盒购于上海生工生物工程有限公司;PCR引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成;Taq酶、dNTPs等试剂购于北京擎科新业生物技术有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

仪器设备：Bio-Rad T100型PCR仪;Fire Read 型凝胶成像仪;热电LYNX6000型高速冷冻离心机;Agilent 1100 高效液相色谱仪和Agilent 6410三重串联四级杆质谱仪;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）;日立HITACHI-TM100台式扫描电镜;HITACHI-7650透射电镜;旋转蒸发仪（RE301）。

1.2 内生菌株的分离与拮抗作用测定

1.2.1 内生菌株的分离

采集的多花黄精样品用自来水冲洗10 min，自然晾干，然后依次用 75%乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗3次，5% NaClO 浸泡6 min，无菌水冲洗5次。样品经表面消毒后，将根、茎、叶用无菌剪刀剪开，茎切成 1 cm 左右的小段，置于 LB 培养基平板和PDA平板上;另取將根、叶加无菌水研磨至糊状，静置 10 min，用无菌水按梯度102～106稀释，取20 μL分别涂布于 LB 平板和PDA平板，同时取表面消毒时最后1次的洗涤水20 μL涂布于LB 平板和PDA平板上，作为对照组以验证消毒是否彻底。每个处理3个重复，置于28℃下培养48 h。选取不同形态特征的单菌落反复平板划线纯化后，将不同菌株菌悬液与20%甘油按照1∶1比例混合，保存于-70℃。

1.2.2 内生菌株拮抗作用测定

采用平板对峙培养法筛选对尖孢镰刀菌F.oxysporum具有抑制作用的菌株。首先将尖孢镰刀菌在PDA平板上于 28℃培养5 d，用直径为5 mm的打孔器在平板上打取圆形病原菌菌饼，将其接入新的PDA平板中央，然后在病原菌菌饼两侧等距离（2.5 cm）处点接分离得到的细菌菌株，于 28℃培养 3 d 后观察记录抑菌圈。每个处理重复3 次，有抑菌圈的菌株即为拮抗菌。

1.3 内生拮抗菌的鉴定

1.3.1 形态学观察

将分离菌株划线接种于LB培养基，28℃培养 24 h 后观察菌落形态特征。进行革兰氏染色，并利用扫描电镜、透射电镜观察菌体、芽胞形态及大小。

1.3.2 生理生化特征分析

将分离菌株划线接种于LB 培养基，37℃培养 24～48 h 后依据《伯杰细菌鉴定手册》[13]对该菌株的生理生化特征进行鉴定。

1.3.3 拮抗菌的16S rDNA序列测定、gyrB基因序列测定及同源性分析

利用细菌基因组提取试剂盒提取拮抗菌株全基因组DNA。采用细菌16S rDNA的通用引物27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，1492R：5′-TAC GGC TAC TTG TTA CGA CTT-3′，以1.2.2筛选到的拮抗菌（ZJU-3）基因组为模板进行16S rDNA PCR扩增。PCR运行程序：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环;72℃延伸10 min。选用引物UP1和UP2r[14] 進行gyrB基因扩增，反应条件：95℃ 4 min;98℃变性10 s，62℃退火1 min，72℃延伸3 min，30个循环;72℃10 min。经1%琼脂糖凝胶电泳检测得到特异性片段，将样品送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将所测得序列登录在NCBI网站，与GenBank中的所有细菌16S rDNA序列进行BLAST比对，选取同源性98%以上的序列，再结合其模式菌株序列，利用MEGA 5.0用邻接法（neighbor-joining，N-J）构建系统发育树，进行同源性分析鉴定。

1.4 菌株ZJU-3脂肽类化合物分析与抗菌检测

1.4.1 MALDI-TOF-MS检测与分析

将活化后的菌株ZJU-3按1%接种于LB液体培养基中，37℃，200 r/min，振荡培养12 h。然后以无菌水稀释后涂布于LB固体培养基37℃恒温培养48 h。挑取2个单菌落于目标板孔靶上，与1 μL辅助基质混匀，自然风干后进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）检测[15]。仪器参数为： 反射操作模式，正离子检测，检测范围100～2 000 Da，激光点击数每图谱50，激光频率30.0 Hz，离子源加速电压 20 kV，反射电压23.5 kV 脉冲离子。

1.4.2 脂肽粗提物的制备

菌株ZJU-3培养：采用LB培养基，100 mL/250 mL三角瓶装量，28℃、180 r/min恒温摇床振荡培养72 h。发酵液经8 000 r/min离心20 min，取上清液用孔径为0.22 μm无菌过滤器过滤，获得无菌发酵液。采取盐酸沉淀和甲醇抽提法从无菌发酵液中获得脂肽粗提物[16]。

1.4.3 脂肽粗提物对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制

采用菌丝生长速率法测定脂肽粗提物的生物活性。用甲醇将得到脂肽粗提液依次稀释为440、 220、110、55 μg/mL，加入到融化的PDA培养基中制成脂肽平板，以加等体积甲醇的PDA平板为对照，在平板中央接种直径为5 mm的尖孢镰刀菌菌块，每个处理重复3次，28℃ 培养4 d。采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率[17]。相对抑制率=[（对照菌落直径-脂肽粗提物处理菌落直径）/对照菌落直径]× 100%。

1.5 菌株ZJU-3对多花黄精的促生作用

1.5.1 菌株ZJU-3发酵液中激素种类分析

将菌株ZJU-3接种至固体LB培养基上，28℃培养24 h后，转接入LB液体培养基内， 37℃ 200 r/min振荡培养12 h，制成种子液。取种子发酵液按照1%接种量接种100 mL的LB液体培养基中，180 r/min振荡培养72 h，之后用乙酸乙酯对发酵液进行萃取，旋转蒸发浓缩，经过0.22 μm滤膜过滤，于4℃保存，用高效液相色谱质谱联用仪（LC-MS）测定吲哚乙酸（IAA）、激动素（kinetin）、赤霉素（GA3）和玉米素（zeatin）的含量[18]。质谱条件如下：采用电喷雾负/正离子模式，毛细管电压3.0 kV，雾化气压力0.31 MPa，干燥气体（N2）流速5 L/min，干燥气体温度325℃，鞘气温度350℃，鞘气流速11 L/min。采用MRM 模式进行检测，收集LC-MS如下数据：样品名称，保留时间，碰撞解离电压，母离子（m/z），子离子（m/z），碰撞能量和扫描模式。

1.5.2 盆栽促生试验

将3年生多花黄精块茎用0.5%次氯酸钠表面消毒15 min，无菌水漂洗3～4次，播种于基质（草炭∶蛭石∶珍珠岩=2∶1∶1）中。设置3个处理。A：LB液体培养基灌根;B：1×108cfu/mL拮抗菌液灌根;C：1×107cfu/mL抗菌液灌根。每处理3盆，3个重复，培养条件：25℃，L∥D=16 h∥8 h，观察多花黄精的生长情况，两个月后记录各个生物量的变化。

1.6 数据分析

采用SPSS 20.0统计分析软件对试验数据进行单因素方差分析，应用最小显著差数（LSD）法检验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 内生菌的分离及拮抗菌鉴定

从根、茎、叶中共分离出11株内生菌，分别记作ZJU-1～ZJU-11（表1），采用平板对峙培养法获得对尖孢镰刀菌F.oxysporum有较强抑制作用的菌株ZJU-3（图1），对尖孢镰刀菌菌落边缘的菌丝进行观察，发现处理组的菌丝明显变粗，菌丝出现断裂、消融现象，表面出现褶皱，表明该菌株对尖孢镰刀菌菌丝的生长产生了一定的抑制作用。

2.2 菌株ZJU-3的鉴定

2.2.1 菌株ZJU-3的菌落形态和生理生化特性

ZJU-3在LB培养基上，28℃下培养24 h后，菌落类似圆形，边缘不规则，皱褶状凸起，表面粗糙不透明，干燥，菌落呈浅黄色（图2a）。扫描电镜观察结果显示，菌体呈杆状，大小为（0.5～0.7）μm×（1～3）μm（图2b），芽胞椭圆，中生或端生，长为0.6～1 μm（图2c～d）。菌株ZJU-3的硫化氢、接触酶等多项生理生化特征的试验结果见表2。

2.2.2 菌株ZJU-3的分子生物学鉴定

菌株ZJU-3经16S rDNA PCR扩增后，得到1条1 400 bp左右的条带，胶回收测序后获得长度为1 425 bp 的DNA序列，将该序列在NCBI上注册，获得序列登录号MH298776。将菌株ZJU-3的16S rDNA序列与GenBank中的序列进行比对，结果表明，ZJU-3与B.velezensis CR-502（GenBank登录号：AY603658）、B.siamensis KCTC 13613（GenBank登录号： AJVF01000043）、B.amyloliquefaciens DSM 7（GenBank登录号：FN597644）的同源性分别为99.85%、99.72% 和99.58%。通过MEGA 5.0构建该菌株的16S rDNA序列系统发育树，显示该菌株与这3个菌株在一个分支上，无法确定其分类地位。

菌株ZJU-3经gyrB基因序列的PCR扩增后，得到1条1 147 bp的条带，该序列与GenBank中B.velezensis strain KACC 13105（GenBank登录号：NZ_JTKJ02000014.1）、B.siamensis strain XY18（GenBank登录号：LAGT01000009.1）、 B.amyloliquefaciens DSM7（GenBank登录号：FN597644）同源性为99%，通过 MEGA 5.0构建该菌株的gyrB序列系统发育树，结果显示该菌株与B.velezensis strain KACC 13105在一个分支上。参考《常见细菌系统鉴定手册》，根据枯草芽胞杆菌B.subtilis和解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens不能产生卵磷脂酶，排除枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌的可能性。结合形态学及其他生理生化特征，将菌株ZJU-3鉴定为贝莱斯芽胞杆菌（于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC No： M 2018311）。

2.3 菌株ZJU-3脂肽类化合物分析

2.3.1 MALDI-TOF-MS检测与分析

图5a为贝莱斯芽胞杆菌经MALDI-TOF-MS检测所得的脂肽类次生代谢物的质谱图（m/z 700～1 500），结果显示：表面活性素和伊枯草菌素的分子离子峰集中于m/z 1 000～1 100（图5b）;泛革素位于m/z 1 400～1 500（图5c）。菌株ZJU-3在m/z值为1 053.6、1 069.6、1 066.7、1 083.7、1 081.6、1 097.7、1 095.7、1 111.7、1 099.7（图5b）处有离子峰，这9个离子峰对应于杆菌霉素的质量;在m/z值为1 066.7、1 082.7、1 080.7、1 094.7、1 098.7（圖5b）处有离子峰，这5个峰对应于伊枯草菌素的质量;在m/z值为1 044.7、1 059.7、1 058.7、1 074.7（图5b）处有离子峰，这4个峰对应于表面活性素的质量。在m/z值为1 435.0、1 450.0、1 464.0、1 478.0、1 492.0、1 506.0（图5c）处有离子峰，这6个峰对应于泛革素的质量。

2.3.2 脂肽粗提物对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制效果

采用酸沉淀和甲醇抽提法从ZJU-3发酵液中提取脂肽物质，进行冷冻干燥后确定该脂肽粗提物的得率为20 mg/mL。尖孢镰刀菌菌块在含不同浓度脂肽粗提物的PDA培养基上23℃培养4 d后，与对照相比，供试浓度下ZJU-3脂肽物质对尖孢镰刀菌菌丝扩展均表现出抑制作用，而且随着脂肽浓度的增加，其抑制作用增强，440 μg/mL时抑制率为51.6%（图6e）。

2.4 菌株ZJU-3对多花黄精的促生作用

2.4.1 菌株ZJU-3发酵液中的吲哚乙酸、激动素、赤霉素和玉米素含量测定

通过LC-MS分析，定量测定菌株ZJU-3中吲哚乙酸（IAA）、激动素（kinetin）、赤霉素（GA3）和玉米素（zeatin）的含量。在同样的色谱条件下，赤霉素标样在3.28 min有一个色谱峰（如图7a1），发酵液在保留时间3.88 min有一个色谱峰（如图7a2），它们的保留时间基本一致，可以确定发酵液中产生了赤霉素，进一步计算得到赤霉素的含量为0.07 ng/mL。

在同样的色谱条件下，标样激动素在保留时间2.48 min有一个色谱峰（如图7b1），发酵液在保留时间2.48 min有一个色谱峰（如图7b2），它们的保留时间一致，可以确定发酵液中产生了激动素，进一步计算得到激动素的含量为21.34 ng/mL。

在同样的色谱条件下，标样玉米素在保留时间1.59 min有一个色谱峰（如图7c1），发酵液在保留时间1.74 min有一个色谱峰（如图7c2），保留时间基本一致，可以确定发酵液中产生了玉米素，经过计算，玉米素含量为0.02 ng/mL。

在同样的色谱条件下，标样吲哚乙酸在保留时间5.94 min有一个色谱峰（如图7d1），发酵液在保留时间5.48 min有一个色谱峰（如图7d2），它们的保留时间基本一致，可以确定发酵液中产生了吲哚乙酸，进一步计算得到吲哚乙酸的含量为8.29 ng/mL。

2.4.2 盆栽促生试验

多花黄精各项生物量如图8所示，菌液处理后，多花黄精芽长差异不明显，但根长、单株根数和芽数差异明显，菌液处理后，根长、根数都明显增加，1×108 cfu/mL处理组的多花黄精部分根长、单株根数相比于对照组增长了44.6%、102.4%，1×107 cfu/mL处理组的多花黄精部分根长、单株根数相比于对照组增长了20.7%、64.5%，而处理组根茎上的芽长明显小于对照组，表明菌株ZJU-3对多花黄精地下部分有更明显的促生长作用，据此猜想与菌体自身产生的内源激素有着密切的联系。

3 讨论

1993 年美国学者Stierle等[22]从短叶红豆杉Taxus brevifolia中分离到内生真菌，其可以产生抗癌药物紫杉醇，这一发现掀起了从药用植物中分离内生菌的热潮。人们逐渐开始研究具有重要经济价值的药用植物与自身内生菌的关联。国内有学者研究表明，内生菌对药用植物生长发育有着巨大影响，植物内生菌自身能够产生次生代谢物，对病虫害产生一定程度的抵抗力[23]。Wen等[24]在药用植物樟脑中发现枯草芽胞杆菌B.subtilis EBS05对小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis的防治效果高达91.2%，并在该拮抗菌株所产生的抗菌物质中分离得到surfactin A，并研究了该物质对根茎生长的作用。邓建良等[25]发现解淀粉芽胞杆菌YN-1发酵液对棉花枯萎病有抑制作用，质谱分析发现其发酵液中含有C14-Iturin A～C16-Iturin A、C14-Fengycin A～C17-Fengycin A、C16-Fengycin B和C17-Fengycin B 9种脂肽类抗生素。本试验采用提取效率更高的酸沉淀法，研究发现B.velezensis ZJU-3能够产生表面活性素、杆菌霉素、伊枯草菌素、泛革素等多种脂肽类化合物，且440 μg/mL浓度的脂肽粗提液对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制率达到51.6%，可抑制病原真菌菌丝生长发育，或许在一定程度上破坏了膜结构，后期将针对脂肽粗提液对孢子的影响展开研究。

同时，研究表明，固氮螺菌属Azospirillum、假单胞菌属Pseudomonas、芽胞杆菌属Bacillus、微杆菌属Microbacterium以及根瘤菌属Rhizobium等多种内生菌可产生植物生长激素吲哚乙酸[2]，促进植物的生長。Lu等[26]发现黄花蒿内生菌在体外培养时，能产生对小麦和黄瓜幼苗生长具有抑制或促进作用的次级代谢产物，对其发酵产物进行深入分析，发现该菌能产生吲哚乙酸。在本研究中发现B.velezensis ZJU-3产生多种植物内源激素如吲哚乙酸、激动素、玉米素，用菌株发酵液对多花黄精植株进行定期浇灌，发现植株的侧根明显增多，根长相比对照组明显增加，植株营养代谢加快。

已有资料表明，在内生菌与植物长期协同进化的过程中，内生菌可能因与植物之间发生基因横向转移或受植物内生环境的影响，具有产生与药用植物相似结构或相似功效的天然产物、甚至新结构或新活性的天然活性产物的潜力[27]。我国学者已从蛇足石杉Huperzia serrata和柳杉叶马尾杉Phlegmariurus cryptomerianus中分离到6种以上的产石杉碱甲的内生真菌，其中一株编号为 Slf14 的 Shiraia 属菌株石杉碱甲产量较高，达到了327.8 μg/L[28]。分离自黄花蒿的青霉属Penicillium内生真菌能有效促进黄花蒿组培苗生长及青蒿素合成[29]。但对于多花黄精来说，内生菌与药用黄精成分的相关性还需进一步深入研究。

综上所述，本研究获得的多花黄精内生贝莱斯芽胞杆菌菌株ZJU-3不但产生多种抗菌的脂肽类化合物，同时产生多种植物内源激素，对多花黄精具有良好的促生长效果，尤其促进植株生根，以上研究为未来该菌株的综合开发利用及研制生防药剂提供了理论依据。

参考文献

[1] HALLMANN J， KLOEPPER J W， MAHAFFEE W F， et al.Bacterial endophytes in agricultural crops [J].Canadian Journal of Microbiology， 1997， 43（10）： 895914.

[2] 喻江， 于镇华， 刘晓冰， 等. 植物根组织内生细菌多样性及其促生作用[J]. 中国农学通报， 2015， 31（13）： 169175.

[3] MNASRI N， CHENNAOUI C， GARGOURI S， et al. Efficacy of some rhizospheric and endophytic bacteria in vitro and as seed coating for the control of Fusarium culmorum infecting durum wheat in Tunisia[J]. European Journal of Plant Pathology， 2017， 147（3）： 501515.

[4] AHMAD F， AHMAD I， KHAN M S. Screening of free-living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities [J].Microbiological Research，2008，163（2）：173181.

[5] HASSAN E D.Plant growth-promoting activities for bacterial and fungal endophytes isolated from medicinal plant of Teucrium polium L.[J]. Journal of Advanced Research， 2017， 8（6）： 687695.

[6] EGAMBERDIEVA D， WIRTH S J， SHURIGIN V V. Endophytic bacteria improve plant growth， symbiotic performance of chickpea （Cicer arietinum L.） and induce suppression of root rot caused by Fusarium solani under salt stress [J]. Frontiers in Microbiology， 2017， 8： 1887.

[7] HAN Qin， WU Fengli， WANG Xiaonan， et al. The bacterial lipopeptide iturins induce Verticillium dahliae cell death by affecting fungal signaling pathways and mediate plant defence responses involved in pathogen-associated molecular pattern-triggered immunity [J]. Environmental Microbiology， 2015， 17（4）： 11661188.

[8] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国科技医药出版社，2015：306307.

[9] 李艳玲，王德才，史仁玖，等.泰山黄精内生真菌的分离鉴定及抑菌活性研究[J].中草药，2013，44（11）：14901494.

[10]汪滢，王国平，王丽薇，等.一株多花黄精内生真菌的鉴别及其抗菌代谢产物[J].微生物学报，2010，50（8）：10361043.

[11]柏晓辉，刘孝莲，刘娣，等.一株黄精内生菌的分离鉴定及抑菌活性研究[J].天然产物研究与开发，2018，30（5）：777782.

[12]方中达.植病研究方法[M].第2版.北京：中国农业出版社，1998.

[13]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[14]YAMAMOTO S， HARAYAMA S. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains [J].Applied Environmental Microbiology， 1995， 61（3）： 11041109.

[15]李兴玉，毛自朝，吴毅歆，等.芽孢杆菌环脂肽类次生代谢产物的快速检测[J].植物病理学报，2014，44（6）：718722.

[16]吕倩，胡江春，王楠，等.南海深海甲基营养型芽孢杆菌SHB114抗真菌脂肽活性产物的研究[J].中国生物防治学报，2014，30（1）：113120.

[17]魏新燕，黃媛媛，黄亚丽，等.甲基营养型芽孢杆菌BH21对葡萄灰霉病菌的拮抗作用[J].中国农业科学，2018，51（5）：883892.

[18]WANG Beibei， SHEN Zongzhuan， ZHANG Fengge， et al. Bacillus amyloliquefaciens strain W19 can promote growth and yield and suppress Fusarium wilt in banana under greenhouse and field conditions [J]. Pedosphere， 2016， 26（5）： 733744.

[19]ONGENA M， JACQUES P. Bacillus lipopeptides： versatile weapons for plant disease biocontrol [J].Trends in Microbiology， 2008， 16（3）： 115125.

[20]CHEN Xiaohua， KOUMOUTSI A， SCHOLZ R， et al. More than anticipated-production of antibiotics and other secondary metabolites by Bacillus amyloliquefaciens FZB42 [J]. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology， 2009， 16（1/2）： 1424.

[21]LI Xingyu， MAO Zichao， WANG Yuehu， et al. Diversity and active mechanism of fengycin-type cyclopeptides from Bacillus subtilis XF-1 against Plasmodiophora brassicae [J]. Journal of Microbiology and Biotechnology， 2013， 23（3）： 313321.

[22]STIERLE A， STROBLE G， STIERLE D， et al. Taxol and taxane production by Taxomycetes andreanae， an endophytic fungus of pacific yew [J].Science，1993，260（5105）：214216.

[23]FAHEEM M， RAZA W， ZHONG W， et al. Evaluation of the biocontrol potential of Streptomyces goshikiensis YCXU against Fusarium oxysporum f.sp. niveum [J].Biological Control，2015， 81（10）： 101110.

[24]WEN Caiyi， YIN Zhigang， WANG Kaixuan， et al. Purification and structural analysis of surfactin produced by endophytic Bacillus subtilis EBS05 and its antagonistic activity against Rhizoctonia cerealis[J]. Plant Pathology Journal， 2011， 27（4）： 342348.

[25]邓建良，刘红彦，刘玉霞，等.解淀粉芽孢杆菌YN-1抑制植物病原真菌活性物质鉴定[J].植物病理学报，2010，40（2）：202209.

[26]HONG Lu， ZOU Wenxin， MENG Juncai， et al. New bioactive metabolites produced by Colletotrichum sp. an endophytic fungus in Artemisia annua[J]. Plant Science， 2000， 151（1）： 6773.

[27]谭小明，周雅琴，陈娟，等.药用植物内生真菌多样性研究进展[J].中国药学杂志，2015，50（18）：15631580.

[28]孙剑秋，郭良栋，臧威，等.药用植物内生真菌及活性物质多样性研究进展[J].西北植物学报，2006，26（7）：15051519.

[29]袁亚菲，董婷，王剑文.内生青霉菌对黄花蒿组培苗生长和青蒿素合成的影响[J].生物资源，2011，33（4）：14.

（责任编辑：田 喆）