蔬菜中四环素和土霉素含量测定的快速前处理方法

崔诗瑶,李婧,苏玉红

(新疆大学 化学化工学院,新疆 乌鲁木齐 830046)

随有机肥施用进入农田[1]或随污水排放进入水域[2],抗生素可通过植物吸收作用进入食物链中[1]或影响环境微生物进化[3],造成人体健康和生态风险[4]。植物中抗生素含量测定的样品前处理方法众多[5],其中Oasis Hydrophilic-lipophilic balanced (HLB)固相萃取(SPE)法广受欢迎[6]。但此法提取时需多次转换溶剂,且Oasis HLB SPE柱价格昂贵。因此,本文以蔬菜中检出率较高的OTC[7]和TC[8]为目标抗生素,以水溶液为提取剂,以分子印迹聚合物为富集净化填料[9-10],意图通过优化条件,建立一种快速、廉价、高效的蔬菜中抗生素含量测定样品前处理方法,为建立蔬菜中抗生素的自动监测技术提供一定思路。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

白菜,购自新疆大学新园市场；7种蔬菜样品,从新疆乌鲁木齐市郊某蔬菜基地中现场采集(先后用自来水和蒸馏水洗净置于室内风干,在45 ℃下烘48 h后粉碎备测)；盐酸土霉素(OTC,97%)、四环素盐酸盐(TC,98%)均为市售；乙腈为色谱纯；甲醇、盐酸(36%～38%)、磷酸均为分析纯。

KQ5200E超声波清洗器；TBL80-2B离心机；LC-20A高效液相色谱仪配备紫外-可见检测器；SHB-III循环水式多用真空；PHS-3C精密pH计；FDY2002-SUV超纯水仪；SHA-82水浴恒温振荡器；JY92-ⅡN超声波细胞粉碎机；RE-52AA旋转蒸发仪；Oasis HLB固相萃取柱(6 mL/200 mg)。

1.2 溶液配制

1.2.1 两种抗生素储备液的配制 分别称取适量TC和OTC标准品,以甲醇为溶剂配制100.0 mg/L的标准储备液,避光冷藏保存备用。

1.2.2 酸化乙腈溶液的配制 以250 mL乙腈中添加2 mL盐酸的比例配制提取液备用。

1.2.3 不同pH值溶液的配制 使用适量盐酸配制的水溶液(pH值分别为2.0,3.0,4.0,5.0)作为提取液备用。

1.3 色谱条件

Spursil C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相为乙腈：0.01 mol/L磷酸水溶液(20/80,V/V)；流速1 mL/min；温度30 ℃；检测波长270 nm；进样量10 μL。

1.4 样品的前处理

1.4.1 样品前处理方法 称取10.000 0 g白菜匀浆于50 mL 离心管中,加入10～30 mL 不同pH的水静置同化10 h,然后进行振荡-超声-离心-过滤提取,将上清液用自制含有MIPs的滤头进行富集3次。富集完成后,滤头用甲醇∶乙酸=9∶1(V/V)的混合液洗脱,将洗脱液用温和的氮气吹至近干,用甲醇定容至0.1 mL后以微孔有机滤膜(0.22 μm) 过滤待测。

1.4.2 方法的加标回收率 称取10.000 0 g白菜匀浆加入50 mL的离心管中,平行11份,其中2份作空白,剩余9份加入两种不同浓度的标准物质(每个浓度平行3份),然后按优化出的最优条件进行实验测定。计算不同加标浓度下的回收率。

1.4.3 固相萃取法(Oasis HLB柱萃取)样品前处理 准确称取10.000 0 g白菜匀浆加入50 mL的离心管中,加入15 mL酸化乙腈溶液振荡5 min-超声细胞破碎(5 s/次10次,400 W)-离心20 min-过滤,残渣用上述方法重复提取2次,合并上清液。往清液中加入2 mL去离子水,旋转蒸发仪上减压蒸发至2 mL左右,先用去离子水稀释浓缩液至50 mL,再通过固相萃取小柱富集后用甲醇洗脱,将洗脱液用氮吹浓缩后,用甲醇定容至1 mL,溶液过0.22 μm滤膜待测。

2 结果与讨论

2.1 提取方式的影响

考察了不同提取方式对白菜中抗生素回收率的影响,分别按以下方案进行提取：①振荡10 min-离心20 min-过滤；②振荡10 min-超声10 min-离心20 min-过滤；③振荡5 min-超声细胞破碎(5 s/次10次,400 W)-离心20 min-过滤；④振荡10 min-超声细胞破碎(5 s/次10次,400 W)-离心20 min-过滤；⑤超声细胞破碎(5 s/次10次,400 W)-离心20 min-过滤。提取后回收率结果见图1。

图1 提取方法对提取蔬菜中两种抗生素回收率的影响Fig.1 The influence of extraction methods on extraction efficiency of two antibiotics in vegetables

由图1可知,提取方式对白菜中两种抗生素的提取回收率有较大的影响。通过方案①和其他几种方案比较,发现超声处理对TC的影响较大,未超声时TC回收率低于20%,而不同提取方法对白菜中OTC提取回收率影响不太大,回收率均达60%以上。综合考虑,选取方案③作为最佳提取方式。

2.2 提取溶液pH值的优化

OTC和TC性质相似,可以在酸性介质中形成具有高溶解度的盐,有利于提取[11]。综上,选取pH值为2.0,3.0,4.0,5.0的提取液进行实验,提取后回收率结果见图2。

图2 提取液pH值对提取蔬菜中两种抗生素回收率的影响Fig.2 The influence of pH value of extraction solvents on extraction efficiency of two antibiotics in vegetables

由图2可知,在pH值为2.0～5.0之间时,白菜中OTC的提取回收率随着pH的增加呈现先增后降的趋势,在提取液pH=3.0时,OTC的提取回收率最高；TC的提取回收率在所选取的pH值范围内无明显趋势,在pH=5.0时,TC的提取回收率最高。根据提取液pH值不同时,抗生素的提取回收率的大小综合考虑,选取pH=3.0的水溶液进行提取。

2.3 提取液用量的选择

按考察出的最优提取方式和最佳pH值对提取液体积进行了优化。根据已有研究表明,固体与液体(植物与提取液)的比例是化学化合物吸附/解吸过程的关键参数[12]。 考虑到两种抗生素的溶解度和MIP在水中的溶胀性能,选取了总体积为10,15,20,30 mL的提取液进行实验。由图3可知,当提取液体积为15 mL时,两种抗生素的回收率效果整体最优,因此选择提取液的体积为15 mL,即植物质量与提取液体积比(固液比)为2∶3 g/mL。

图3 固液比对提取蔬菜中两种抗生素回收率的影响Fig.3 The influence of solid-liquid ratio on extraction efficiency of two antibiotics in vegetables

2.4 植物样品中抗生素的加标回收率

用上述优化的预处理方法进行分析,当添加浓度为100～1 500 μg/kg时,计算得白菜样品中OTC和TC不同加标浓度下的平均加标回收率分别为(71.1±3.83)%和(53.49±3.77)%(n=9) (表1)。表明该方法的准确度和精密度能满足实际蔬菜样品分析要求。

表1 白菜中两种抗生素的实际回收率及相对标准偏差Table 1 Recoveries and relative standard deviation of two antibiotics in cabbage

2.5 Oasis HLB柱萃取方法的加标回收率

为了验证所建立的方法的准确性和可靠性,采用较为常用的前处理方法-Oasis HLB固相萃取法对白菜中两种抗生素进行加标回收处理,在相同的色谱条件下进行测定,两种抗生素的实际加标回收率及相对标准偏差见表2。

表2 Oasis HLB柱萃取法提取白菜中两种 抗生素的实际加标回收率及相对标准偏差Table 1 Recoveries and relative standard deviation of two antibiotics in cabbage by Oasis HLB

由表2可知,在不同加标浓度下,OTC和TC的加标回收率分别为53.47%～88.99%和68.25%～88.66%；RSD分别为0.51%～9.04%和0.82%～8.41%。实验结果与文献报道值相近[13]。

2.6 实际样品的测定

利用本文所建立的分析方法,对新疆乌鲁木齐市郊某蔬菜基地中现场采集的7种蔬菜同时进行了分析,结果见表3。

表3 实际样品中OTC和TC的含量测定结果Table 3 Determination results of OTC and TC in field samples

注：ND为未检出。

由表3可知,7种实际样品中两种抗生素的检出浓度差异显著。有两种样品中未检出OTC和TC,其中西红柿和长豇豆中两种抗生素均未检出,白菜和西兰花中TC检出含量较高,萝卜中OTC的检出含量最高。表明同一块地域,不同植物中抗生素含量的多少与植物种类有关[8]。

3 结论

结合分子印迹技术,建立了一种蔬菜中四环素和土霉素含量测定的快速前处理方法,并对其提取条件进行了优化。对蔬菜样品的分析结果表明,该方法能够满足实际样品的分析要求。与传统利用有机溶剂提取的固相萃取方法比较,本方法具有价格低廉、环境友好、可用于建立现场自动监测技术等特点。