基于HPLC指纹图谱技术评价“虎杖叶药材-虎杖叶胶囊”化学成分一致性研究

王 欣，覃 瑶，孙建彬，罗维早,*

(1.重庆市中药研究院，重庆 400065；2.太极集团有限公司，重庆 401147；3.成都中医药大学 药学院，四川 成都 610072)

虎杖叶为彝医常用药材，虎杖叶胶囊是以单味彝药虎杖叶经提取制成的胶囊剂，两者均能用于治疗肝阳上亢引起的头昏头晕，即高血压病[1]。HPLC指纹图谱技术可用于中药的化学成分一致性研究。本研究采用HPLC-UV指纹图谱技术，分析比较两者间的化学成分种类及数量，评价“虎杖叶药材-虎杖叶胶囊”间化学成分的相似性，为虎杖叶及虎杖叶胶囊的进一步开发提供科学依据。

1材料

1.1 仪器

CPA225D型电子天平：十万分之一，德国赛多利斯公司；KQ5200型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；TGL-16G型离心机：上海安亭科学仪器厂；2010C HT型高效液相仪：紫外检测器，LC-Solution色谱工作站，日本岛津公司；2004年版中药色谱指纹图谱相似度评价系统。

1.2 试剂

乙腈：色谱纯，美国TEDIA公司；其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 对照品

芦丁(100080-200707)、阿魏酸(10773-200611)、绿原酸(110753-200413)、异槲皮苷(111809-201403)、槲皮素(10081-9905)、白藜芦醇(111535-200502)、虎杖苷(111575-200502)购自中检所；大黄素甲醚(10104-201312)、大黄素(10103-201305)购自南昌贝塔生物科技有限公司；大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(150810)、瑞诺苷(150904)、扁蓄苷(151217)、大黄素-1-O-β-D-葡萄糖苷(151108)购自四川省维克奇生物科技有限公司；金丝桃苷(J-012-150826)购自成都瑞芬思生物科技有限公司；没食子酸和咖啡酸为自制；槲皮苷购自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.4 试药

虎杖叶药材共10批(Y007-15060102，湖北，S1；Y007-150602，湖南，S2；Y007-151001，四川，S3；Y007-150601，云南，S4；Y007-150602，云南，S5；Y007-15060101，江西，S6；Y007-150301，云南，S7；Y007-20161101，产地不详，S8；Y007-20160902，产地不详，S9；Y007-20160903，产地不详，S10)。虎杖叶胶囊6批(批号：20151202，S11、20160401，S12、20160402，S13、20160403，S14、20161201，S15、20161203，S16)，均由云南龙海天然植物药业有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 样品制备方法

2.1.1 药材溶液制备 取虎杖叶药材粉末(过3号筛)0.50 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入80%甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min(功率200 W，频率40 kHz)，放冷，80%甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.2 成品溶液制备 取虎杖叶胶囊内容物粉末0.10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min(功率200 W，频率40 kHz)，放冷，甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱：美国Phenomenex公司Gemini-NX C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；检测波长：270 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：20 ℃；进样量：10 μL。流动相为乙腈(A泵)-0.4%甲酸水溶液(B泵)，梯度条件：0～10 min(90%～87% B)，10～30 min(87%～85% B)，30～45 min(85%～84% B)，45～50 min(84%～80% B)，50～75 min(80%～75% B)，75～95 min(75%～70% B)，95～105 min(70%～35% B)，105～120 min(35%～30% B)，120～125 min(30%～5% B)。HPLC色谱见图1、图2。

1.没食子酸；2.绿原酸；3.阿魏酸；4.虎杖苷；5.芦丁；6.异槲皮苷；7.槲皮苷；

1.没食子酸；2.绿原酸；3.阿魏酸；4.虎杖苷；5.芦丁；6.异槲皮苷；

2.3 系统适应性试验

取槲皮苷对照品溶液，按“2.2”项下方法测定，理论塔板数以槲皮苷计，不小于150 000。

2.4 方法学研究

前期研究中，虎杖叶药材和虎杖叶胶囊指纹图谱的方法学均符合相关要求[2-3]。

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1样品测定药材(10批)和成药(6批)，共计16批样品，按“2.1”项下样品制备方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，精密吸取各供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，记录125 min色谱，见图1、图2，对各样品的HPLC图谱中的色谱峰进行比较和编号，采用对照品保留时间比对，16批样品的HPLC图谱中标注了11个共有色谱峰，作为特征峰。16批样品HPLC图谱中11个特征峰的保留时间见表1。

表1 共有色谱峰保留时间 (min)

2.5.2内参照峰选定7号色谱峰为槲皮苷，该色谱峰分离度较好，无干扰，槲皮苷色谱峰峰面积占总峰面积的50%左右，故选定槲皮苷为内参照峰(S)。

2.5.3 HPLC指纹图谱考察运用中华人民共和国国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版对16批样品的HPLC指纹图谱进行相似度分析，将HPLC数据导入中药指纹图谱相似度计算软件中，以虎杖叶2号为参照谱，通过均值法计算得出样品指纹图谱的共有模式，各样品指纹图谱及共有模式见图3。

图3 16批样品指纹图谱与对照谱

2.5.3 相似度评价以“2.5”项下建立的对照谱为标准，对16批样品进行相似度评价，见表2，从表2可知，除虎杖叶3号药材外，其余15批样品的相似度值均大于0.980，说明药材与成品之间化学成分一致性较好。虎杖叶3号药材的槲皮苷含量低，而槲皮素含量高，原因可能为：虎杖叶3号药材在储存、运输等过程中，药材中槲皮苷已被降解成槲皮素。

表2 16批样品相似度结果

3 讨论

HPLC指纹图谱研究发现，药材中槲皮素的含量低，而成品中槲皮素的含量高，其影响因素有2个：①虎杖叶胶囊提取工艺中的转移率；②虎杖叶胶囊生产过程中，虎杖叶药材中的黄酮苷成分(槲皮苷、异槲皮苷、芦丁、瑞诺苷、扁蓄苷及金丝桃苷等)降解为槲皮素苷元。

前期对虎杖叶药材及虎杖叶胶囊的化学成分研究发现，其主要成分为酚酸、黄酮及蒽醌等酸性成分[4-5]，HPLC流动相选用甲酸优化峰型，乙腈的分离效果优于甲醇，即HPLC流动相体系选定为乙腈-0.4%甲酸水溶液，梯度洗脱125 min可使大部分的色谱峰得到基线分离；当柱温为20 ℃时，各成分间的分离效果最好；检测波长为270 nm时，HPLC图谱中色谱峰信息最丰富。