化瘀壮骨汤对胫骨骨折模型大鼠骨痂中TGF1、bFGF及BMP-7表达的影响

张彦伟，李 兵

(濮阳惠民医院 骨外科，河南 濮阳 457000)

骨愈合的过程受生物化学、血液循环状态、人体微量因子及生物物理因子调控的影响、属于一种有序、复杂的生物学修复过程[1]。研究表明[2]，10%的骨折由于各种因素的影响致使骨折无法愈合或愈合延缓，所以如何缩短骨折愈合时间，促进骨折愈合非常重要。探讨骨折愈合的机制能够为临床治疗提供可靠的理论依据，化瘀壮骨汤为本院医师多年总结出的验方，有消肿止痛、活血化瘀的功效，是骨折治疗的常用中药制剂。本研究构建SD大鼠胫骨骨折模型，以探讨化瘀壮骨汤对其骨痂中相关生长因子(TGF-β1、bFGF及BMP-7)表达的影响。

1 材料及方法

1.1 材料

雄性清洁级大鼠48只(购自上海SLAC实验动物公司)，合格证：SCXK(沪)2013-0005。平均体质量(275±25)g。适应性喂养1周，普通饮食和喂水。

1.2 化瘀壮骨汤制备

化瘀壮骨汤成分：丹参100 g，骨碎补、续断各150 g，炒胡瓜子、自然铜各100 g，土元90 g，水煎至100 mL浓缩液(剂量根据体质量60 kg成人的10倍剂量[2])，并4℃下保存。

1.3 模型构建

麻醉用戊巴比妥钠(30 g/L)，根据40 mg/kg剂量腹腔注射。大鼠小腿内侧脱毛消毒，仰卧位固定，于胫骨骨干中部上1/3处皮肤做1.5 cm切口，暴露出胫骨骨干，用骨锯锯成横行骨折，再用克氏针(规格：2 mm)向上(逆行)打入胫骨的上端，并穿出皮肤，将克氏针尾钳断，顺行打进胫骨干。最后活力碘冲洗，并在骨折的周围滴入抗生素(庆大霉素)4滴，皮肤缝合后归笼。正常饲养，并连续3天肌注青霉素6～8万U，以预防感染。经X线检查显示大鼠左股骨骨折，髓内针固定在位，对位良好，表明造模成功[3]。48只大鼠均造模成功。

1.4 分组与干预

造模成功后将大鼠随机分为两组。化瘀壮骨组自造模当日麻醉苏醒后给予化瘀壮骨汤100 mL分早晚2次灌胃，模型组给予等量的生理盐水灌胃。化瘀壮骨组及模型组均分别连续灌胃3天、1周、2周、4周。每个时间点均随机处死大鼠6只。

1.5 苏木精-伊红染色

用尖刀将骨折端组织(1.0～1.5 cm)取下，并置于多聚甲醛40 g/L溶液中，4 ℃下固定48 h。脱钙后梯度乙醇脱水，并进行流水蓝化、在脱水、分色及透明树脂封固。最后置于显微镜下观察。

1.6 TGF-β1、bFGF及BMP-7表达检测

检测用免疫组织化学法(SP)。检测方法严格按照说明书中步骤进行(二甲苯脱蜡、不同浓度乙醇水合、PBS漂洗、枸橼酸钠缓冲液加热盒抗原修复、加一抗、加二抗、显色复染、脱水封片，用Image-Pro Plus6.0软件分别对TGF-β1、bFGF及BMP-7的平均光密度值进行分析)。

1.7 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料采用(x±s)表示，采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠骨折愈合及组织学变化情况

分析由苏木精-伊红染色可知，骨折1周时，有骨痂出现，主要有成熟及未成熟软骨细胞，骨折处皮质附近软骨细胞表现肥大，局部有少量的新生骨小梁，周期有成骨细胞。化瘀接骨汤组的骨膜反应比模型组明显，骨痂2周时达最大，内部有成骨细胞代替软骨细胞，镜下活血接骨组能见到少量新生编织骨。模型组主要表现为较成熟的软骨细胞。在骨折4周时化瘀接骨组的新生编织骨有明显增加，骨小梁明显变粗，骨髓腔形成，能见到成熟的骨组织，骨痂(内外)开始变薄。而模型组的骨小梁数目较化瘀接骨组少，且其间有少量软骨细胞。见图1。

注：A1、A2、A3分别为模型组1周、2周、4周时组织学变化；B1、B2、B3分别为化瘀壮骨组1周、2周、4周时组织学变化(HE×100)。

2.2 两组大鼠各时间点TGF-β1、bFGF及BMP-7表达

化瘀壮骨组骨折1周、2周、3周及4周时TGF-β1、bFGF及BMP-7表达与模型组比较，均有不同程度的升高(P<0.05)。骨折2周时化瘀壮骨组bFGF表达明显高于模型组(t=3.929，P=0.003)；骨折3周时化瘀壮骨组TGF-β1、BMP-7表达明显高于模型组(t=2.605、3.152，P=0.01、0.002)。见表1、图2。

时间TGF-β1模型组化瘀壮骨组bFGF模型组化瘀壮骨组BMP-7模型组化瘀壮骨组骨折1周0.173±0.0260.191±0.0200.189±0.0170.212±0.0330.193±0.0430.196±0.050骨折2周0.161±0.0430.169±0.0170.207±0.0330.283±0.034a0.204±0.0290.246±0.059骨折3周0.139±0.0370.189±0.029a0.183±0.0270.185±0.0340.136±0.0210.193±0.039a骨折4周0.124±0.0280.141±0.0180.121±0.0200.131±0.0110.130±0.0150.150±0.016

注：与模型组比较，aP<0.05。

注：模型组A、化瘀壮骨组A为骨折3周时TGF-β1表达；模型组B、化瘀壮骨组B为骨折2周时bFGF表达；模型组C、化瘀壮骨组C为骨折3周时BMP-7表达。

图2 两组大鼠TGF-β1、bFGF及BMP-7表达情况(SP×200)

3 讨论

祖国医学中显示，骨折主要的病机为瘀血阻滞，因此古代医家多从“血”论治，有了“瘀未去则骨不接”“折伤专主血论”及“瘀去则新骨生”的说法[4]。现代药理学研究则表明[5]，骨折后的局部组织甚至全身血液往往在高凝状态，骨组织的损伤使机体产生应激反应，出现微循环障碍，使血液动力受到影响，这些病理特征均与血瘀相关。因此，改善骨折机体的“血瘀”状态，就能使骨组织灌注得到改善。化瘀壮骨汤为本院长期实践得出的治疗骨折的验方，方中丹参为君药，能去旧生新，活血化瘀，续断、骨碎补则能补肝益肾，土元接筋续骨，破血散瘀，共为臣药，炒甜瓜子止痛化瘀，自然铜接骨续筋，同为佐药，诸药合用，达到接骨续筋的目的。现代药理研究证实[6]，丹参还具有补益肝肾之功，使筋脉有滋养，骨化生有源，促进骨折后受损组织瘀血吸收，为骨折新生创造良好环境。骨碎补能够使蛋白多糖(促进钙化因子)合成增加，从而加速骨的生长。自然铜主要成分之一为二氧化硫，其能够增强骨的抗撕力，加速骨痂的形成[7]。有研究显示[8]，土元提取物使血管新生加快，能够促进肉芽组织生长。本研究对骨折组织形态变化观察发现，化瘀壮骨组大鼠新生骨数量与骨膜反应改善比模型组明显，由此证实化瘀壮骨汤具有接骨通络之功。

TGF-β1为转化生长因子家族成员，广泛在人体组织中存在，特别在骨组织中生物活性广泛，可促进细胞的增殖、分化，参与组织的修复，诱发软骨的形成等。有研究显示，TGF-β1能够诱导纤维连接蛋白及细胞外基质的形成。bFGF属于一种骨代谢调节因子，在骨吸收及骨形成中起重要作用。BMP-7属于骨形态发生蛋白(BMPs)家族中一员，是一类分子量较低的肽类物质，在骨基质中广泛存在。BMP-7能够促使骨间充质干细胞转化为软骨细胞及成骨细胞，从而促进骨组织修复。本研究结果显示，与模型组比较，化瘀壮骨组大鼠接受化瘀壮骨汤治疗后，骨痂组织中TGF-β1、bFGF及BMP-7表达在各个时间点均有不同程度的升高，尤其在骨折愈合的2周或3周，两组间表达有显著性差异，由此提示，化瘀壮骨汤能够使骨痂组织中TGF-β1、bFGF及BMP-7表达升高，从而达到促进骨折愈合的目的。此结果与王希强等[10]的研究一致。

综上所述，化瘀壮骨汤能够促进大鼠骨折愈合，其作用机制可能与促进骨痂组织中TGF-β1、bFGF及BMP-7表达有关。本研究也有不足之处，未能对大鼠血清中相关生长因子水平进行分析，这也是下一步研究的方向。