HPLC测定维格列汀中的2种基因毒性杂质

吴文惠，王少卿

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.烟台万润药业有限公司，山东 烟台 264006)

维格列汀(vildagliptin)，化学名：1-[(3-羟基-金刚烷基-1-氨基)乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈[1-[(3-Hydroxy-adamant-1-ylamino)acetyl]-pyrrolidine-2(S)-carbonitrile]，是诺华公司开发的二肽基酶Ⅳ(dipeptidyl peptidaseⅣ,DPP-Ⅳ)抑制剂[1]，用于2型糖尿病的治疗，具有选择性高、竞争性强、可逆性高的特点[2]。维格列汀合成中间体(S)-1-(2-氯乙酰氯)吡咯烷-2-甲酰胺(VGN-A)和(S)-1-(2-氯乙酰氯)吡咯烷-2-甲腈(VGN-B)具有基因毒性警示结构[3]。本文首次建立了测定维格列汀中潜在基因毒性杂质的有效方法。基因毒性杂质可根据毒理学关注阈值(threshold of toxicological concern，TTC)来设定限度[4]。TTC值是每人每天摄入限量1.5μg[5]。维格列汀的最大日剂量为100 mg，根据TTC 值限定其基因毒性杂质的含量不得超过0.0015%。

1 仪器与试药

岛津LC-10AT高效液相色谱仪(紫外检测器)、维格列汀原料药(烟台万润药业有限公司，批号：VPVGN14001、VPVGN14002)；维格列汀对照品(KQRG1707191批，99.7%)；VGN-A对照品(KQLei1706242-2批，99.48%)；VGN-B对照品(KQLei1706241-2批，99.85%)；乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为辛烷磺酸钠溶液(取辛烷磺酸钠2.1 g，加水溶解并稀释至1000 mL，用磷酸调节pH值至2.1)；流动相B为乙腈，梯度洗脱(程序见表1)，检测波长210 nm；流速1.0 mL·min-1；进样体积20 μL；柱温30℃。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的配制

精密称取维格列汀原料药约200 mg，置10 mL量瓶中，加流动相A-乙腈(80∶20)溶解并定容，得20 mg·mL-1供试品溶液。精密称取维格列汀对照品约3 mg，置100 mL量瓶中，加流动相A-乙腈(80∶20)溶解并定容，得30 μg·mL-1维格列汀对照品贮备液，将其定量稀释10倍，得维格列汀对照品溶液。精密称取VGN-A对照品约3 mg，置100 mL量瓶中，加流动相A-乙腈(80∶20)溶解并定容，得30 μg·mL-1VGN-A对照品贮备液，将其定量稀释10倍，得VGN-A对照品溶液。精密称取VGN-B对照品约3 mg，置100 mL量瓶中，加流动相A-乙腈(80∶20)溶解并定容，得30 μg·mL-1VGN-B对照品贮备液，将其定量稀释10倍，得VGN-B对照品溶液。精密量取维格列汀对照品储备液、VGN-A对照品储备液和VGN-B对照品储备液各10 mL，置100 mL量瓶中，加流动相A-乙腈(80∶20)溶解并定容，得约含维格列汀、VGN-A、VGN-B各3 μg·mL-1的系统适用性溶液。

2.3 专属性实验与系统适用性实验

分别取空白溶剂流动相A-乙腈(80∶20)、维格列汀对照品溶液、VGN-A溶液、VGN-B溶液、系统适用性溶液，在“2.1”项的色谱条件下测定，维格列汀、VGN-A、VGN-B的定位图谱见图1～3。结果显示：溶剂峰不干扰测定(见图4)，维格列汀峰与VGN-A峰和VGN-B峰的分离度均大于3.0(见表2，图5) ，专属性好。

表2 系统适用性溶液色谱图中各色谱峰的保留时间和分离度

图1 VGN-A

图3 维格列汀

图4 溶剂

图5 系统适用性溶液

2.4 重复性、中间精密度与溶液稳定性实验

取VPVGN14001批供试品溶液，在“2.1”项的色谱条件下连续进样6次。未检出VGN-A，计算得VGN-B的RSD=5.75%，表明方法的重复性好；同法配制供试品溶液，两名分析人员平行测定6次，未检出VGN-A，计算得VGN-B的RSD=9.44%，表明方法的精密度符合要求。取VPVGN14002批供试品溶液，分别在0、140、280、420、560、700、840 min进样20 μL，VGN-A和VGN-B均未检出，维格列汀峰面积的RSD=0.87%，表明供试品溶液室温放置14 h稳定。

2.5 耐用性实验

在“2.1”项的色谱条件下，改变柱温(25℃、35℃)、流速(0.8 mL· min-1、1.2 mL· min-1)、流动相A的pH值(1.9、2.3)以及两种不同品牌C18色谱柱，进行耐用性试验的考察，结果见表3。结果显示：当改变以上系统条件时，系统适用性溶液色谱图中维格列汀峰与VGN-A峰和VGN-B峰的分离度均大于3.0，符合系统适应性试验要求。

表3 不同色谱条件下系统适用性溶液色谱图中各色谱峰的保留时间和分离度

2.6 检测限和定量限

取“2.2”项的VGN-A对照品贮备液、VGN-B对照品贮备液，加流动相A-乙腈(80∶20)稀释成不同质量浓度的溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样20 μL，记录色谱图，根据 3 倍噪音计算系统对样品的检测限、10 倍噪音计算系统对样品的定量限。VGN-A、VGN-B的检测限溶液的质量浓度分别为0.004533 μg·mL-1、0.004763 μg·mL-1，检测限分别为0.091 ng、0.095 ng；定量限溶液的质量浓度分别为0.01511 μg·mL-1、0.01429 μg·mL-1，定量限分别为0.030 ng、0.029 ng。

2.7 线性和范围

精密量取“2.2”项的VGN-A贮备液、VGN-B贮备液，分别用流动相A-乙腈(80∶20)逐级稀释，配置成一系列质量浓度的线性溶液，分别进样20 μL，记录色谱图。以峰面积Y对样品质量浓度X作线性回归，结果见表4。结果表明VGN-A、VGN-B的质量浓度与峰面积线性关系良好。

表4 线性范围考察结果

2.8 加样回收率

精密称取供试品9份，每份约200 mg，置10 mL量瓶中，每组3份分别平行加入高、中、低三种体积的VGN-A对照品贮备液、VGN-B对照品贮备液，用流动相A-乙腈(80∶20)定容，分别进样，按外标法以维格列汀峰面积计算VGN-A、VGN-B的含量和回收率。VGN-A、VGN-B的平均回收率分别为99.0%、93.2%，RSD分别为4.7%、5.4%，符合定量分析的要求。

3 讨论

药物中基因毒性杂质的检测灵敏度和选择性要求高，常规的HPLC或GC方法一般达不到检测药物中痕量基因毒性杂质的灵敏度要求，多选用液质联用技术或气质联用技术进行测定[3]。本文采用常规的HPLC法，在相关参考文献[6]基础上优化了梯度洗脱的程序，VGN-A、VGN-B的检测限分别为0.004533 μg·mL-1、0.004763 μg·mL-1，定量限分别为0.01511、0.01429 μg·mL-1，灵敏度显著提高，两个杂质的定量限和检测限均显著低于杂质限度(0.3 μg·mL-1)，能满足基因毒性杂质的检测要求。该方法下两杂质与主峰的分离度均大于3.0，确保了该方法的专属性。本实验从专属性和系统适用性、溶液稳定性、耐用性、加样回收率、线性和范围、重复性与中间精密度、检测限和定量限等方面进行了分析方法验证，为检测两种潜在基因毒性杂质VGN-A和VGN-B的含量提供了可靠性依据，且该方法操作简单，不需联用质谱即可对基因毒性杂质进行高灵敏度的可靠测定。