CSN6基因在肝细胞癌组织中的表达及临床意义

曲雁飞 刘 超 王勃军 方 琳 张艳桥，2

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)在世界范围内是发病率第六高的癌症，也是癌症导致的死亡率第三高的恶性肿瘤[1-2]。对于肝细胞癌患者，手术切除是根治肝细胞癌的最有效的方式[3]，但是大部分的肝细胞癌患者在疾病诊断时已发生转移，失去手术机会。目前对于肝细胞癌缺少准确的预测预后的分子标志物和有效的治疗靶点。所以，寻找肝细胞癌早诊和预后标志物，对于提高肝细胞癌的早期诊断率，提高患者的5年生存率具有重要意义[4]。

COP9信号复合体(Constitutive photomorphogenesis 9 signalosome，COPS，CSN)最早是在植物拟南芥中发现的一种高度保守的蛋白质复合物，广泛存在于真核生物中[5]，参与多种蛋白的泛素化降解过程[6]。组成型光形态发生因子9信号复合体亚基6(CSN6，COPS6)是COP9信号复合体的八个亚基之一，是组成该复合体的核心之一[7]。目前多项研究证实，CSN6在多种肿瘤中，包括乳腺癌[8]、结直肠癌[9]、胆管癌[10]和卵巢癌[11]等表达升高，提示该蛋白可能参与肿瘤的进展。但是CSN6在肝细胞癌中的研究未见报道，本研究旨在探索CSN6在肝细胞癌患者中的表达和临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集

本研究中应用的病理组织标本来源于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院，于2013年1月—2015年12月期间进行肝细胞癌手术的患者，共106例。所有的肿瘤组织均由我院病理科进行石蜡包埋处理，蜡块置于-20℃冻存。研究的入排标准：(1)所有病例术前未进行放化疗和介入治疗；(2)临床病理信息完整；(3)术后病理学明确诊断为肝细胞癌；(4)排除合并胆管细胞癌及其他第二肿瘤；(5)排除拒绝提供预后信息的患者。本研究符合医学伦理规定，并得到哈尔滨医科大学附属肿瘤医院医学伦理委员会的批准，所有患者均签署了相关知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 肿瘤基因相关公共数据库 人类蛋白质图谱数据库(The Human Protein Atlas)中调取肝癌[12]和肝脏组织[13]中CSN6蛋白的免疫组化结果，明确其在肝细胞癌和正常肝脏组织中的蛋白表达。StarBase数据库分析肝细胞癌和正常肝脏组织中CSN6的mRNA表达情况[14]。TCGA数据库提取肝细胞癌CSN6表达数据和肝细胞癌患者的临床病理信息，分析CSN6表达与预后和临床病理因素的相关性[15]。

1.2.2 公共数据库与本研究中心病例随访信息的收集 TCGA数据库中的随访信息由TCGA官方网站定期更新和维护，本研究中涉及到的肝细胞癌的随访信息更新时间为2018年11月。本研究中心的患者随访起始时间为病人出院开始，终止时间为2019年4月或者病人死亡，中位随访时间为28个月。总生存期(OS)定义为患者疾病确诊直至患者死亡或随访终止的时间。

1.2.3 免疫组化 免疫组化分析106例肝细胞癌病理组织中的CSN6的表达。石蜡组织切片在70℃烤箱中烘烤过夜，第二天分别经过二甲苯、100%、95%、85%和75%的酒精脱蜡以及水化，柠檬酸修复液煮沸修复，过氧化氢和3%BSA封闭，CSN6抗体(1∶50，sc393023)孵育过夜，第三天用鼠源二抗孵育，DAB显色，苏木素染核，脱水封片等处理。免疫组化评分参考IRS评分方法[16]，即染色强度分为阴性(0)，弱阳性(1)，中度阳性(2)，强阳性(3)；染色范围分为0～25%(1)，26%～50%(2)，51%～75%(3)和76%～100%(4)，每张组织的CSN6评分为两者得分的乘积。

1.3 统计学方法

数据的统计处理利用SPSS 18.0软件完成，计量资料采用方差分析和t检验。χ2检验分析用来分析CSN6表达与各临床病理因素间的关系。Kaplan-Meier生存曲线和Log-rank检验进行生存分析，单因素和多因素COX回归分析肝细胞癌患者预后影响因素，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CSN6在肝细胞癌组织中的蛋白表达和RNA表达情况

调取人类蛋白质图谱数据库(The Human Protein Altas)中的正常肝脏组织(n=3)和肝细胞癌组织(n=13)组织芯片中的CSN6的表达情况，分析发现CSN6在肝细胞癌组织中的表达明显高于正常肝脏组织(P<0.05)(图1A)。进一步调取StarBase数据库的CSN6基因在肝细胞癌(n=374)和正常肝脏组织(n=50)中的mRNA数据，对比显示CSN6的mRNA表达水平在肝细胞癌组织中明显升高(P<0.001)(图1B)。结果说明CSN6的蛋白和RNA水平在肝细胞癌组织中明显升高。

2.2 CSN6在肝细胞癌TCGA数据库中的表达和临床意义

为了进一步分析CSN6在肝细胞癌中表达的临床意义和对预后的提示作用，本研究下载了TCGA数据库中的CSN6的表达数据和临床数据进行分析。对TCGA临床数据中包含的TNM分期数据和肿瘤的病理分级情况加以分析，结果发现，CSN6在T2、T3分期的患者中的表达情况均高于T1期患者(图2A)；CSN6在TNM分期的Ⅱ、Ⅲ期患者中的表达均高于Ⅰ期患者(图2B)；CSN6在病理分级高的肿瘤组织中的表达高于G1和G2分级的患者(图2C)。虽然在T4期和Ⅳ期的患者中没有发现与低分期患者间在表达上的统计学差异，但是我们考虑可能和这两组患者的数量较少有关。

图1 公共数据库中CSN6在肝脏组织和肝细胞癌组织中的表达Figure 1 Expression of CSN6 in normal hepatic tissues and hepatocellular carcinoma tissues in public databasesNote：A The expression of CSN6 protein in normal hepatic tissues and hepatocellular carcinoma tissues in the Human Protein Atlas database，scale bar =200 μm；B The expression of CSN6 mRNA in normal hepatic tissues(n=50)and hepatocellular carcinoma tissues(n=374)in the StarBase database.* P<0.05，when compared to the corresponding group.

图2 TCGA数据库的肝细胞癌中CSN6的表达和临床意义Figure 2 Expression and clinical significance of CSN6 in hepatocellular carcinoma of the TCGA databaseNote：A.Expression of CSN6 in different T stages；B.Expression of CSN6 in different TNM stages；C.Expression of CSN6 in different tumor pathological grades.The expression of CSN6 and prognosis were analyzed in hepatocellular carcinoma from TCGA database；D.All stages；E.Early stage；F.Middle and late stages.ns P>0.05，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001，when compared to the corresponding group.

CSN6在肝细胞癌预后指导上的意义，也通过对该数据进行生存曲线的分析得以评价。在所有TNM分期的患者中发现，高表达CSN6组(n=82)的预后明显低于低表达CSN6组(n=282)，中位总生存期为837天vs. 1 852天(图2D)。在早期的患者(TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期)中，高表达CSN6组(n=56)的预后明显低于低表达CSN6组(n=198)，中位总生存期为2 532天vs. 3 258天(图2E)。在晚期的患者(TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期)中，高表达CSN6组(n=12)的预后明显低于低表达CSN6组(n=74)，中位总生存期为344天vs. 802天(图2F)。这一结果提示，CSN6对于所有分期的肝细胞癌患者的总生存期具有一定的指导意义。

2.3 CSN6表达水平与临床病理因素的关系

TCGA数据库中包含的临床病理因素相对局限。为了更加广泛地分析CSN6与肝细胞癌患者其它临床病理因素的相关性，我们收集了106例肝细胞癌患者术后的组织标本，进行免疫组化和统计学分析。免疫组化检测了106例肝细胞癌患者的病理组织，并利用IRS评分方法进行评分，结果显示CSN6在大多数的肝细胞癌组织中存在表达，将评分大于或者等于6分的分为高表达组(n=37)，评分低于6分的分为低表达组(n=69)(图3A)。CSN6表达与各个临床病理因素的关系分析显示，CSN6高表达与肿瘤分化程度和乙肝病毒感染有关(表1)。进一步的单因素和多因素回归分析显示，肿瘤分化程度低、TNM分期晚和CSN6高表达是肝细胞癌患者预后不良的独立预测因素(表2)。

2.4 CSN6表达水平与肝细胞癌患者预后的关系

我们结合本中心组织标本信息和患者的总生存时间，分析CSN6在肝细胞癌患者肿瘤组织中的表达对总生存期的潜在指导价值。Kaplan-Meier生存曲线和Log-rank检验分析显示，CSN6低表达组患者的总生存期明显优于CSN6高表达组(中位总生存期：1 463天vs.858天)(图3B)。这一结果提示，CSN6表达情况可能成为预测肝细胞癌患者预后的潜在标志物，可以为肝细胞癌患者疾病发展的判断提供了一定指导。

表1 CSN6基因表达与肝细胞癌患者各临床病理因素的关系

表2 各临床病理因素与肝细胞癌患者预后关系的单因素和多因素分析

图3 CSN6在肝细胞癌病理组织中的表达和对患者预后的指导Figure 3 Expression of CSN6 in the pathology of hepatocellular carcinoma and guidance for patient prognosisNote：A.High expression and low expression of CSN6 in the pathology of hepatocellular carcinoma, scale bar =200 μm；B.Overall survival analysis of hepatocellular carcinoma patients with high expression of CSN6 and patients with low expression of CSN6.

3 讨论

HCC在男性和女性中分别是发病率第五和第七位的恶性肿瘤[13]，并且具有所有癌症中第三高的死亡率[17]。该疾病的特征在于根治性切除术后的高复发率和对药物治疗的抵抗性。此外，由于缺乏准确的早期诊断和有意义的治疗，大多数HCC患者在诊断时处于晚期[18]，这导致大部分患者预后不良。因此，临床医生迫切需要用于诊断、预后和治疗的新型候选生物标志物。

研究表明[19]，CSN6作为COP9的复合体的亚基之一，它既构成了COP9信号复合体的核心部件发挥作用，同时发现在多种恶性肿瘤中表达升高。而且CSN6在肿瘤中表达升高是具有其临床意义的。在结肠癌中的研究中发现，CSN6在结肠癌组织中表达升高，而且高表达CSN6往往提示患者总生存期更短，基于多因素分析显示，CSN6是结肠癌患者预后的独立预测因素[20]。在恶性间质瘤[10]和乳腺癌[21]的研究中也发现了类似的结论。提示检测CSN6的表达在指导肿瘤的临床预后方面具有潜力。基于对CSN6在肿瘤细胞中的功能学研究发现，CSN6在促进肿瘤增殖[22]、侵袭和转移[10]、抑制细胞凋亡[19]、诱导细胞周期进展[23]等方面都具有重要作用，CSN6可以基于这些作用诱导肿瘤的恶性演进。

在本研究中，基于公共数据库信息和本中心临床组织样本我们首次证实，CSN6在肝细胞癌中表达升高，而且对于患者的预后具有提示作用。基于多个公共数据库的多样本信息的交叉验证，提高了研究结果的准确性，明确了CSN6在肝细胞癌中表达升高的现象。TCGA的数据分析显示，CSN6在不同进展程度和恶性程度患者肿瘤组织中存在表达差异，而且提示了CSN6在肝细胞癌患者中表达情况对预后的预测作用。对本中心的样本进行的分析，再次验证了CSN6在肝细胞癌患者组织中的表达情况。基于更加丰富的临床病理信息的验证，发现CSN6的表达与肿瘤分化程度和乙肝病毒感染具有相关性。这一结果的发现为CSN6在肝细胞癌中的表达升高的意义和潜在机制的研究方向提供了一定指导。而且进一步的分析证实，CSN6是影响肝细胞癌患者预后的独立预测因素。

综上所述，本研究丰富了CSN6在肝细胞癌中的表达和临床意义的研究，证明了CSN6在肝细胞癌中表达升高并对肝细胞癌患者的预后具有指导作用，为针对其作为肝细胞癌新的诊断标志物和治疗靶点的研究提供了证据。