基于赣南脐橙指纹图谱的主成分及UPLC-Q-TOF-MS分析

祝爱艳 梁 露 侯金雪 李昱昊 孙雪峰 杨延峰 王远兴

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室 南昌330047）

柑橘是世界上产量最大的水果，我国也是柑橘种植和产量大国之一[1]。赣南是中国脐橙主产区，赣南脐橙是属于芸香科、柑桔属，特征为果顶有脐，像人的肚脐眼，故而得名，是江西省的一种名贵特产[2-3]。脐橙口感脆嫩，营养丰富，富含黄酮类、柠檬苦素类等多种活性成分[4]。大量研究表明，脐橙中的生物活性成分具有抗氧化，预防癌症，调节免疫力，抗过敏，抗衰老等多种生理活性[5-7]。指纹图谱是实现鉴别真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式，具有信息量大，特征性强，整体性和模糊性等特点，已在环境保护、食品评价、中药质量控制[8-10]等许多领域中得到应用。红外光谱法、高效液相色谱法、气相色谱法和气-质联用法、液-质联用法等方法均可生成指纹图谱[11-17]。刘世尧[18]通过对奉节脐橙的指纹图谱研究，对其质量评价，建立了有效的指纹图谱，并说明其具有伪冒果品鉴定的应用价值。Wang 等[19]利用高效液相建立了龙葵的指纹图谱，对其建立相应的数据库，进行质量控制。主成分分析是一种多元统计分析技术，它是一种降维或者把多个指标转化为少数几个综合指标的一种方法[20]。唐会周等[21]通过主成分对市售脐橙的香气成分进行分析，得到影响脐橙品质的香气成分，表明脐橙香气成分的主成分分析可作为脐橙香气品质的评价方法。张晓丽等[22]利用荧光结合主成分对橙汁进行品质鉴别，结果表明这两种方法相结合可为橙汁品质鉴别提供技术支持。超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）联用技术是复杂样品中化学组成分析和鉴定的重要分析工具，能够在缺少标品的情况下对粗提物中微量成分进行结构分析、鉴定，具有高分辨率、高灵敏度、高选择性、高质量精度等优点。

近年，随着中国柑橘栽培面积的扩大，区域特色植物赣南脐橙受到周边产区伪冒果品的严重影响。以其自身品质特征为基础，建立有效的真伪鉴定与品质评价方法，可树立赣南脐橙品牌，提高市场竞争力。本试验中采用高效液相建立赣南脐橙指纹图谱，通过比较相似度、共有峰分析其谱图间差异性，利用主成分探讨赣南脐橙在产地的分类情况，并用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）定性分析共有峰成分，以期完善赣南脐橙质量评价体系，树立赣南脐橙的品牌。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验用赣南脐橙采摘于瑞金、信丰和安远等赣南和非赣南各地，见表1。采用新鲜、无病虫害的赣南脐橙，每个地区在不同地方采集6 个点。每组样品选取6 个大小均匀、无损伤的去皮、去核的果实，将其可食部分打碎混匀，用于试验分析。

甲醇（色谱纯），德国Merck 公司；甲酸（色谱纯），ROE 公司；水，屈臣氏蒸馏水。

表1 赣南脐橙信息Table 1 The information of navel orange samples in Gannan

1.2 仪器与设备

AL104 电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ5200E 型超声波清洗器，机械昆山市超声仪器有限公司；TDL-5-A 型离心机，上海安亭科学仪器厂；料理机，九阳股份有限公司；Agilent1290高相液相色谱仪（四元泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD 检测器），美国Agilent 公司；Agilent6538 高分辨率飞行时间质谱联用仪 （配有Agilent1290 高效液相色谱仪、Agilent Mass Hunter 数据处理软件与电喷雾离子源），美国Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 样液的制备 精确称取1.00 g 赣南脐橙果肉匀浆，加入2 mL 蒸馏水超声提取20 min，置于离心机中5 000 r/min 离心20 min，将收集的上清液用0.22 μm 水系滤膜过滤，然后测定。

1.3.2 色谱条件 色谱柱：Agilent-C18 column（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：以0.1%甲酸水溶液为流动相A 和甲醇为流动相B 进行梯度洗脱，洗脱梯度为0～12min，3%～30% B；12～27 min，30%～78% B；27～32 min，78%～95% B；32～37 min，95%～3% B。检测波长254 nm，柱温35 ℃，流速0.3 mL/min，进样量5 μL。

1.3.3 质谱条件 雾化气压力2.76×103Pa，干燥气流速10.0 L/min，干燥气温度350 ℃，毛细管电压4.0 kV，扫描方式为全扫正离子模式，扫描范围（m/z）50～1 000。

1.4 数据处理

利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版”进行数据处理，对所得色谱图进行比较，得到全面反映多个色谱图特征的赣南脐橙的对照指纹图谱，得到共有峰。将其共有峰中时间居中的峰作为参照峰，并以参照峰的峰面积为分母，各共有峰的峰面积为分子，求得其相对峰面积。利用SPSS22.0 软件对共有峰进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 指纹图谱的方法学考察

2.1.1 精密度试验 按照样品的制备方法随机抽取同一批次的赣南脐橙制备样液，1d 内连续进样6 次，测定液相色谱，考察色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的一致性。结果表明：其色谱峰的相对保留时间和峰面积的比值基本没有变化，各共有峰相对保留时间RSD≦0.39%，相对峰面积RSD≦2.39%，表明仪器精密度良好。

2.1.2 重现性试验 随机抽取同一批次的赣南脐橙样品，按照制备方法平行制备6 份测试液，测定液相色谱，比较其相对保留时间和相对峰面积。结果表明：各共有峰相对保留时间RSD≦0.62%，相对峰面积RSD≦2.56%，重现性良好。

2.1.3 稳定性试验 取同一批次的赣南脐橙制备的样液，分别在制备后24 h 内每隔4 h 进样1 次，测定液相色谱，比较色谱峰的相对保留时间、相对峰面积。结果表明：各共有峰相对保留时间RSD≦0.28%，相对峰面积RSD≦1.76%，表明所制备的样液在24 h 内稳定性良好。

2.2 指纹图谱的构建

2.2.1 指纹图谱的建立 将S1-S14 赣南脐橙样品按1.3.1 节方法制备样液，在1.3.2 节色谱条件下测定，得到各产地赣南脐橙的HPLC 图。对其HPLC 图经中药色谱指纹图谱相似度评价系统处理，获得其高效液相对照指纹图谱R，并建立14批赣南脐橙的指纹图谱，见图1[横坐标为保留时间（min），纵坐标为所获信号（mV）]。

图1 14 批赣南脐橙的指纹图谱Fig.1 Fingerprints of 14 batches of navel orange samples in Gannan

2.2.2 共有峰和参比峰的确定 根据14 批赣南脐橙指纹图谱的检测结果，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统的匹配功能，确定21 个色谱峰作为特征成分，组成其指纹图谱，在对照指纹图谱上标定21 个共有峰，见图2。保留时间17.655 min即19 号共有峰峰面积相对稳定，保留时间均一致，分离度良好，故选为参照峰，以其峰面积为1，计算其它各峰的相对峰面积。各产地脐橙的共有峰保留时间与相对峰面积见表2。由表2可知，各成分的色谱峰的相对峰面积有较大差异，说明其含量差别较大，可能是由于各产地赣南脐橙品种资源、生态环境、生长年限、地域性等条件的影响。

2.2.3 相似度评价 相似度作为中药指纹图谱的评价参数，可以最大限度地避免主观因素影响，以实现对指纹图谱整体相似性的客观评价。采用中药色谱指纹图谱相似评价系统，以生成的对照指纹图谱与其14 批样品进行比较，结果见表3。

图2 赣南脐橙的指纹图谱共有模式Fig.2 Common pattern of the fingerprint of Gannan navel orange samples

表2 赣南脐橙指纹图谱共有峰的相对峰面积Table 2 The relative peak areas of the flngerprints of common peaks of navel orange samples in Gannan

表3 14 批赣南脐橙的指纹图谱间的相似度Table 3 The similarity of flngerprints from 14 batches of navel orange in Gannan

两个n 维模式矢量夹角余弦越大 （接近1），它们越相似。由表3可知，14 批赣南脐橙样品与对照指纹图谱的相似度都在0.90 以上，表明所测样品的组分具有很强的相似性，各组间成分较为一致。

2.3 赣南脐橙真伪的识别

实际应用中，通常以相似度制定真伪鉴别标准，相似度低于该值的样品可看作不合格的样品，一般设置相似度0.8 为阈值。对样品S15～S18 以同样条件分析。以2.2 节建立的赣南脐橙纹图谱为对照，利用中药色谱指纹图谱相似评价系统（2004.A）评价其相似度，结果见表3。根据相似度系数将样品分2 类：第1 类是编号S15、S16 的样品，相似度系数大于0.8；编号S17、S18 的样品为第2 类，相似度系数小于0.8。根据相似度结果判定S15、S16 号样品为赣南脐橙，S17、S18 号样品非赣南脐橙，与检测样品本身属性完全吻合。结果表明，本研究建立的赣南脐橙指纹图谱可以很好地鉴别赣南脐橙和非赣南脐橙，进一步验证所建立的赣南脐橙指纹图谱的准确性，说明其具有鉴定伪冒果品的应用价值。

2.4 主成分分析结果

SPSS22.0 软件对原始数据进行标准化处理，以主成分的特征值及贡献率为依据，对14 批不同产地赣南脐橙的21 个共有峰（变量）进行主成分分析，见表4。主成分的数目不仅要满足数据降维的目的，而且要尽可能综合多的信息，一般累积方差贡献率不低于80%。由表4可知，可取前4 个作为主成分，其累计贡献率达到85.75%，4 个主成分足以说明该数据的变化趋势。

表4 4 个主成分的特征值及其贡献率Table 4 Eigenvalues and cumulative contribution of 4 principal components

因子负荷反映各指标对主成分贡献的大小，因子负荷的符号指各指标对改变主成分值的增减效果[23]。由表5可知，第1 主成分反映的指标主要有共有峰1，2，3，10，14，7，18，其中共有峰1 和共有峰2 对第1 主成分较强的逆负荷，说明其含量越高，第1 主成分值越少。共有峰3，10，14，17，18对第1 主成分有较强的正负荷，说明其含量越高，第1 主成分值较大，而剩下的共有峰对第1 主成分影响较小。同理可得第2 主成分和第3 主成分的主要影响指标。通过旋转后的公共因子载荷矩阵表筛选共有的特征成分，发现决定性作用的化学成分。本试验筛选出的特征成分未知，需要结合质谱等手段进一步确定。

根据表2、表4和表5中2 的数据，以第1 主成分值为横坐标，第2 主成分值为纵坐标，可得赣南脐橙在第1 和第2 主成分上的分布，还有21 个共有峰在第1 和第2 主成分上的分布，见图3。

表5 旋转后的公共因子载荷矩阵表Table 5 Load matrixes of postrotational common factors after spinning

由图3a 可知，每个点都由原21 维空间的样本点降维映射而来，反映14 个样品的分类情况。由图中各样点的位置大致可将其分为4 类：Ⅰ类包括S10，S13；Ⅱ类包括 S3、S8、S11；Ⅲ 类包括S2；其余的归为Ⅳ类。瑞金的地理位置和其他地方较远，信丰、寻乌与剩下的地方相较远，而剩下的地方较为相近，在主成分的得分图上可以反映地理位置对其影响。由此可得地理位置相近，其各个成分的含量较为一致。由图3b 可知，各共有峰对第1 和第2 主成分的影响，也可判断主成分的主要影响指标。

图3 赣南脐橙的主成分分析得分图（a）和因子载荷图（b）Fig.3 Score plot（a） and loading plot（b） from PCA of navel orange in Gannan

2.5 共有峰的鉴定结果

样品经1.3.1 节方法制备，在1.3.2 节色谱条件和1.3.3 节质谱条件下测定，对其共有峰进行鉴定，结合离子碎片和相关文献，可推断3 个共有峰的化合物，见表6。

表6 赣南脐橙共有峰的UPLC-ESI-QTOF-MS 数据Table 6 UPLC-ESI-QTOF-MS data of common peaks of navel orange samples in Gannan

共有峰13 母离子[M+H]+m/z 为581.1829，共有峰18 母离子[M+H]+m/z 为581.1828，它们的二级质谱都有m/z 为273.0758 即[M+H-308]+碎片离子峰，为丢失了m/z 308 的鼠李糖-葡萄糖的碎片离子。芸香柚皮苷和柚皮苷为同分异构体，相对分子质量580，根据相关文献[24]，[25]推断：共有峰13 为芸香柚皮苷，共有峰18 为柚皮苷。共有峰19母离子[M+H]+m/z 为611.1932，其二级质谱特征碎片离子峰m/z 为465.1385，449.1434，431.1332，303.0856，二级质谱特征碎片离子峰中的303.0856 是其丢失了m/z 为308 的鼠李糖-葡萄糖的碎片。根据文献[26]推断其可能为橙皮苷。

3 结论

利用高效液相谱建立了赣南脐橙不同产地脐橙的指纹图谱，并对其化学模式进行识别。结果表明，样品的出峰数目、分离度均较理想，并标定出21 个共有峰。通过其方法学考察和相似度计算，建立的指纹图谱可较为全面地反映赣南脐橙的特征。同时准确鉴定了赣南和非赣南脐橙，为赣南脐橙的质量控制提供了参考。利用主成分分析，将共有峰成功实现降维。由PCA 载荷得分结果，看前4个主成分累积贡献率85.75%，由主成分的得分图可以将赣南脐橙根据产地分为4 类。利用UPLCQ-TOF-MS 鉴别共有峰，结合质谱信息和相关文献，推断3 个共有峰化合物分别是芸香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷。

综上所述，运用指纹图谱和主成分分析可实现快速分析，发挥各自优势，互相验证和补充，多角度综合评判赣南脐橙的质量。然而，对于共有峰未尚未全部鉴别。在今后的研究中，应结合质谱对其它共有峰进行鉴别。同时扩大采样范围，加强研究的系统性和深入性，使研究结果更具实用价值。