绿豆肽对RAW264.7巨噬细胞增殖及免疫活性物质的影响

杨 健 郭增旺 刁静静 马 萍 李朝阳 于 笛 王凯凯 张丽萍*

（1 国家杂粮工程技术研究中心 黑龙江大庆163319 2 黑龙江八一农垦大学 黑龙江大庆163319）

目前科学家们正在积极寻找和研究天然、安全的，可保证身体健康以及调节人体疲劳，增强免疫力的保健功能食品。在众多的保健功能食品研究中，蛋白肽不乏是重点研究对象之一，尤其是水解形成多肽后的保健效果已被科学家广泛认可[1-2]。肽类物质被证实是涉及人体内多种细胞功能的重要物质，可以合成细胞，并调节细胞的功能活动[3-4]。我国有丰富的绿豆资源，绿豆被公认为安全性高、无毒性的保健食品，受到国内外消费者的广泛关注。近年来对绿豆肽的保健机制研究越来越重视，尤其是免疫调节机制的研究日益增多[5-6]。

绿豆肽（MBPs）具有提高人体免疫力的活性，能够提高脾脏生成抗体细胞数、半数溶血值和小鼠的淋巴细胞增值力，同时能够促进巨噬细胞吞噬能力[7-8]。巨噬细胞是机体中重要的免疫效应细胞，在机体中发挥着防御、监视、调节以及抗原呈递等极其重要的免疫作用，对于机体的免疫系统平衡非常重要[9-10]。巨噬细胞还具有重新构建组织，修复损伤细胞，清除凋亡细胞的功能，因此巨噬细胞在宿主的免疫应答过程中的作用不容忽视[11-12]。活化的巨噬细胞具有广谱的杀菌作用，近几十年来对免疫活性肽的药理和临床研究，一直把活化巨噬细胞作为一项重要的研究方向[13]，然而有关MBPs 对巨噬细胞的免疫调控作用还未有报道。本试验以小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7为研究对象，通过测定MPBs 及MPBs+LPS 对巨噬细胞的增殖活性、胞内糖原、核酸、ATPase、LZM、SOD 等活性及细胞因子的分泌水平的影响，探讨绿豆肽对巨噬细胞的免疫调控作用，为绿豆肽的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

绿豆肽 （水解度32.25%），实验室自制；RAW264.7 细胞，武汉大学；DMEM 培养基，Gibco；胎牛血清，Hyclone；PBS，北京索莱宝科技有限公司；胰酶，碧云天；LPS，Biosharp；MTT 和DMSO，Sigma；PAS 染色液，Baso；吖啶橙和抗荧光淬灭剂，Solarbio；溶菌酶（LZM）检测试剂盒，USCN；超氧化物歧化酶（SOD）WET-1 法测定试剂盒，南京建成；BCA 蛋白浓度测定试剂盒，Wanleibo；细胞因子试剂盒，联科生物有限公司；其它试剂为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司。

主要试剂的配制：MBPs 溶液，取100 mgMBPs溶解于5 mL 的PBS 中，过滤、灭菌，配成20 mg/mL 的使用液；LPS，将10 mg LPS 溶 于2 mL 的PBS 中，配成5 mg/mL 的储存液；0.1 mol/L PBS，将29 g Na2HPO4、3 g NaH2PO4、85 g NaCl 溶 于500 mL 蒸馏水中，定容1 000 mL；0.01%吖啶橙，将10 mg 吖啶橙粉末溶于100 mL PBS 中，调节pH 4.8～6.0，过滤，避光保存。

1.2 设备、仪器

超纯水系统（NW10LVF），Heal Force；超速冷冻离心机（H-2050R），湖南湘仪；CO2培养箱（HF-90），上海力申；倒置相差显微镜（AE31），麦克奥迪；超净工作台（SW-CJ-2FD），苏州净化；荧光显微镜 （BX53），OLYMPUS；酶标仪 （ELX-800），BIOTEK。

1.3 试验方法

1.3.1 MBPs 的制备方法 绿豆蛋白→加水（底物浓度1∶10）→加热处理（95 ℃、10 min）→冷却→调pH 8.5，温度60 ℃→加3% Alcalase 2.4 L 碱性蛋白酶→恒温、恒pH 水解3 h→灭酶 （95 ℃、10 min）→300 u 的透析袋流动水透析脱盐48 h→冷冻干燥→MPBs 固体粉末。

1.3.2 试验分组与处理 试验组1：LPS 组加入2 μg/mL 的LPS 处 理24 h；MBPs 组 分 别 加 入10，50，100，200 μg/mL 的绿豆肽处理24 h，对照组只加入等量PBS。

试验组2：LPS 组先培养4 h，再加入2 μg/mL的LPS 处理24 h；MBPs+LPS 组分先别加入10，50，100，200 μg/mL 的MBPs 处理4 h，再加入2 μg/mL 的LPS 处理24 h。RAW264.7 用含10%小牛血清的DMEM 培养基（含100 IU/mL 青霉素和100 IU/mL 链霉素） 在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，待细胞长至对数生长期时，用0.25%胰酶（含0.01% EDTA）消化，DMEM 培养基洗涤离心，PBS 重新洗涤离心后接种到培养皿中，6 孔板每孔500 μL，12 孔板每孔350 μL，按试验分组培养。收集6 孔板中各组细胞及上清液进行蛋白及细胞因子相关指标检测；收集12 孔板中各组细胞，用4%多聚甲醛室温固定20 min，进行免疫活性成分相关检测。

1.3.3 蛋白质抽提与定量 蛋白质抽提：根据细胞量加入9 倍体积的PBS，吹散至单细胞悬液，液氮反复冻融3 次，12 000 r/min 离心10 min，蛋白样品在上清液中，在保证不吸入沉淀的操作下吸取所需上清液，于-20 ℃保存。以标准蛋白设置不同浓度梯度，绘制浓度与吸光度值对应的值，得到回归方程。

图1 蛋白质浓度测定标准曲线Fig.1 Standard curve of protein concentration

1.3.4 MTT 检测巨噬细胞增殖 将各组细胞加入5 mg/mL 的MTT，置于37 ℃培养箱中孵育4 h，小心吸去上清，加入200 μL DMSO 以溶解细胞形成的紫色结晶，在酶标仪上测定其在波长490 nm 处OD 值，进行数据分析。

1.3.5 巨噬细胞活性成分的测定

1） 糖原的测定 蒸馏水清洗→高碘酸溶液氧化→雪夫试剂染色→苏木素复染→自来水返蓝→脱水、封片、镜检。

2） DNA 及RNA 的测定 爬片4%多聚甲醛固定→吖啶橙染色→抗荧光淬灭剂封片→镜检。

3） 酸性ATP 酶（ATPase）的测定方法 ATPase 活性检测试剂盒法。

4） 溶菌酶LZM 测定 溶菌酶（LZM）检测试剂盒法。

5） 超氧化物歧化酶SOD 活力测定 超氧化物歧化酶（SOD）WET-1 法测定试剂盒法。

1.3.6 细胞因子的测定 采用酶联免疫吸附试验（ELISA） 测定细胞上清液中细胞因子IL-6、IL-1α、TNF-α、IFN-γ 液的含量，按照试剂盒说明书中的方法测定。

1.4 统计分析

所有试验结果至少重复3 次，取平均值。用Graphpad prism5 进行数据记录及作图，以±s 表示。采用SPSS 19.0 进行方差分析和Duncan 式进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 MTT 法检测巨噬细胞增殖

以不同浓度MBPs 培养巨噬细胞24 h，对巨噬细胞增殖的影响见表1。

以不同浓度的MBPs 单独培养巨噬细胞4 h，加入2 μg/mL 的LPS 处理24 h，巨噬细胞增殖检测结果见表2。

表1 MBPs 添加量对巨噬细胞增殖的影响Table 1 The effect of MBPs adding amount on macrophage proliferation

表2 MBPs+LPS 对巨噬细胞增殖的影响Table 2 Effect of MBPs+LPS adding amount on macrophage proliferation

由表1可知，LPS 组的OD490nm显著 （P＜0.05）低于PBS 空白对照组，表明LPS 对巨噬细胞具有明显的抑制作用；10 μg/mL 的低浓度MPBs 试验组对巨噬细胞的增殖率和PBS 空白对照组没有显著差异（P＞0.05）；而随着MPBs 的浓度增加，MPBs对巨噬细胞的增殖作用显著提高（P＜0.05），并呈浓度依赖性。这说明MPBs 对巨噬细胞没有毒性作用。MBPs+LPS 对细胞增殖的影响试验表明：当MBPs 质量浓度为10 μg/mL 和50 μg/mL 时，不能显著降低LPS 对巨噬细胞的抑制作用；而随着MPBs 的浓度升高时，显著降低了LPS 对巨噬细胞的抑制作用。LPS 作为一种细胞毒素，对巨噬细胞具有一定的激活作用，刺激巨噬细胞产生NO 和释放细胞免疫因子等生物活性物质，适量的免疫因子可提高机体抵抗外界刺激和修复机体损伤的作用，而过量持续的刺激产生的免疫活性物质则会引起细胞的炎症反应，导致细胞的损伤和凋亡[15]。阳性对照组的LPS 对巨噬细胞增殖产生显著（P＜0.05）的抑制作用。当以质量浓度高于100 μg/mL MPBs 培养巨噬细胞时，显著降低LPS 对增殖的抑制作用。这说明MPBs 能在一定程度上对巨噬细胞起保护功能，降低了LPS 对巨噬细胞的强烈刺激及提升了巨噬细胞对外界刺激的耐受能力，从而提高了增殖率。其机理还有待进一步研究。

2.2 MBPs 对巨噬细胞糖原和核酸的影响

2.2.1 MBPs 对糖原的影响 以不同浓度的MBPs对巨噬细胞培养后，采取PAS 法染色，在放大倍数为200 倍的显微镜下使用DP73 成像，采集到的染色结果见图2。

图2 不同浓度MBPs 对巨噬细胞内糖原的影响Fig.2 Effect of different concentrations MBPs on glycogen in macrophages

糖原是细胞内储藏能量的多糖类物质，糖原增多，在一定程度上体现巨噬细胞经刺激后的巨噬细胞活力和代谢能力的增加。由图2可知，巨噬细胞受LPS 和高浓度的MPBs 刺激后，细胞内紫色颗粒颜色加深，块状聚团程度增加，胞内糖原颗粒增加。低浓度MPBs 组与空白对照组相比差异不明显，说明低浓度的MPBs 对巨噬细胞的糖原代谢影响较小。这和不同浓度的MPBs 对巨噬细胞增殖能力的影响一致。

2.2.2 MBPs 对核酸的影响 以不同浓度的MBPs对巨噬细胞培养后的吖啶橙染色，在荧光显微镜下放大400 倍，结果见图3。

图3 不同浓度的MBPs 对巨噬细胞内核酸的影响Fig 3 Different concentrations of MBPs for nucleic acid in macrophages

图3中，淡绿色荧光为核内DNA 染色效果，橘红色荧光为胞质内RNA 染色效果。随着MBPs的浓度增大，细胞核内的DNA 和RNA 染色程度均逐渐增加，并显著高于空白对照组及LPS 阳性对照组。DNA 是细胞内的遗传物质基础。RNA 是遗传信息的载体，主要有3 种，即：信使核苷酸mRNA、转运核苷酸tRNA 和核糖体核苷酸rRNA，主要功能为实现遗传信息在蛋白质上的表达，而蛋白质是机体免疫防御功能的物质基础。随着MPBs 浓度的升高，RNA 表达量升高，细胞内的核酸代谢能力增强，为蛋白质的合成提取前期物质基础，使巨噬细胞的活性在基因表达水平上有了一定的提升。

2.2.3 MBPs 对巨噬细胞中ATPase 的影响 MBPs单独培养巨噬细胞对巨噬细胞中ATPase 的影响结果见图4。以MBPs+LPS 培养巨噬细胞，对ATPase 的影响见图5。

图4 MBPs 对巨噬细胞中ATPase 活性的影响Fig.4 Effect of MBPs on ATPase activity in macrophages

图5 MBPs+LPS 对巨噬细胞中ATPase 活性的影响Fig.5 Effect of MBPs+LPS on ATPase activity in macrophages

ATPase 存在于线粒体内膜，是一种能够水解ATP，并利用ATP 水解释放出的能量，驱动物质跨膜运输的运输蛋白。ATPase 酶的活性直接影响巨噬细胞的增殖及免疫活性。由图4可知，LPS 具有显著抑制ATPase 酶活力的作用[16]。以不同浓度MBPs 培养的巨噬细胞中ATPase 的活力增加，且较阳性对照组差异显著（P＜0.05）。由图5可知，以不同浓度MBPs 培养巨噬细胞后用LPS 刺激与单独LPS 刺激作对比，发现MBPs 可以显著降低LPS 对巨噬细胞ATPase 活力的抑制作用，并与浓度呈正相关。这和之前的试验MBPs 对巨噬细胞糖原的作用结果一致。

2.2.4 MBPs 对巨噬细胞LZM 和SOD 活力的影响

2.2.4.1 对LZM 活力的影响 用MBPs 单独培养巨噬细胞，对巨噬细胞内LZM 含量的影响见图6。以MBPs+LPS 培养巨噬细胞，对LZM 含量的影响见图7。

溶菌酶（LZM）是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶[17]，主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4 糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出，使细菌溶解，从而具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗肿瘤等广泛的药理作用。由图7、图8可知，LPS 显著抑制巨噬细胞内LZM 含量。MPBs 对巨噬细胞内LZM 的含量有一定促进作用，并随着浓度的升高，促进作用增强，当MPBs质量浓度超过50 μg/mL 时，巨噬细胞内的LZM含量较对照组显著提高。此外，MPBs 还可在一定程度上降低LPS 对LZM 的抑制作用，减弱LPS 对巨噬细胞的过度刺激，并且MPBs 浓度越高，效应越显著，当MPBs 的质量浓度达到200 μg/mL 时，LZM 含量和正常组基本相当且差异不显著。MPBs具有提高巨噬细胞LZM 含量的作用。

2.2.4.2 对SOD 活力的影响 MBPs 单独培养巨噬细胞对巨噬细胞内SOD 活力的影响见图8。以MBPs+LPS 培养巨噬细胞，对SOD 活力的影响见图9。

图6 MBPs 对巨噬细胞内LZM 含量的影响Fig.6 Effect of MBPs on LZM content in macrophage

图7 MBPs+LPS 对巨噬细胞内LZM 含量的影响Fig.7 Effect of MBPs+LPS on LZM content in macrophage

图8 MBPs 对巨噬细胞SOD 活力的影响Fig.8 Effect of MBPs on SOD macrophages SOD vitality

图9 MBPs+LPS 对巨噬细胞SOD 活力的影响Fig.9 Effect of MBPs+LPS on macrophages SOD vitality

超氧化物歧化酶（SOD）是一种广泛存在于生命体内，具有抗氧化作用的活性酶，可将有害的超氧自由基转化为过氧化氢，进而被分解，具有重要的生理意义[18]。由图8、图9可知，LPS 对巨噬细胞内SOD 活力具有显著（P＜0.05）抑制作用。MBPs在低质量浓度（10 μg/mL）时，没有促进巨噬细胞内SOD 的活性；50 μg/mL MBPs 时对巨噬细胞内SOD 活性作用效果不显著（P＞0.05）；而MBPs 质量浓度为100 μg/mL 以上时，对巨噬细胞中SOD活力有显著（P＜0.05）的促进作用；MBPs 可以降低LPS 对巨噬细胞SOD 活性的抑制，且MPBs 浓度越高，效应越显著。MPBs 具有提高巨噬细胞SOD 活力的作用，能缓解LPS 对巨噬细胞SOD 活力的抑制作用。

2.2.5 MBPs 对巨噬细胞因子分泌的影响 用MBPs 单独培养巨噬细胞，对细胞因子含量的影响见表3。以MBPs+LPS 培养巨噬细胞，对细胞因子含量的影响见表4。

细胞因子是指一类由免疫细胞产生的调节细胞功能的高活性多功能多肽或蛋白质分子，可以调节全身的免疫应答反应。细胞因子不仅具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等多方面的作用，还可介导发生病理性作用，导致某些病理过程的发生。IL-6、IL-1α、TNF-α、IFN-γ 是细胞因子中重要的促炎性因子[19]。由表3可知，MPBs 可显著上调巨噬细胞促炎性细胞因子IL-6、IL-1α、TNF-α、IFNγ 的表达，在低浓度时对细胞因子的分泌能力也具有显著（P＜0.05）的促进作用。由表4可知，与LPS 阳性对照组相比，MBPs 可以显著（P＜0.05）下调促炎性细胞因子IL-6、IL-1α、TNF-α、IFN-γ 的表达，并且MPBs 浓度越高，效应越显著。MPBs 具有上调巨噬细胞促炎性细胞因子的分泌，并能下调LPS 诱导的巨噬细胞促炎性因子的分泌。

表3 MBPs 对RAW264.7 细胞分泌细胞因子（IL-6、IL-1α、TNF-α、IFN-γ）的影响（pg/mL）Table 3 Effect of MBPs on cytokines （IL-6，IL-1α、TNF-α and IFN-γ） levels in macrophage（pg/mL）

表4 MBPs+LPS 对RAW264.7 细胞分泌细胞因子（IL-6、IL-1α、TNF-α、IFN-γ）的影响（pg/mL）Table 4 Effect of MBPs + LPS on cytokines （IL-6，IL-1α，TNF-α and IFN-γ） levels in macrophage（pg/mL）

3 讨论

巨噬细胞属于免疫细胞，是单核吞噬细胞系统内的高度成熟、分化的一种类型。其具有多方面的生物功能，主要包括非特异性免疫防御，清除外来细胞，非特异性免疫监视，呈递抗原，分泌干扰素及补体等，在机体的免疫应答方面具有重要的作用。而MPBs 是由绿豆蛋白水解得到的高生物活性成分。有研究表明绿豆蛋白肽具有提高免疫力的活性，具有免疫调节作用[6，20]。本试验主要研究其对巨噬细胞的免疫活性物质的调节作用。

MBPs 对巨噬细胞的增殖和细胞内活性物质具有较明显的促进作用，表明MBPs 通过促进巨噬细胞增殖，活化巨噬细胞，上调细胞因子的表达，发挥免疫作用。另一方面，LPS 作为一种细胞内毒素，在低浓度时可以激活巨噬细胞，促进免疫；而较高浓度的刺激可对巨噬细胞产生副作用，抑制巨噬细胞的增殖。MBPs 对LPS 的这种抑制有抵制作用，起到保护巨噬细胞的作用。然而，MBPs是如何诱导巨噬细胞发挥免疫激活和调节的机理尚不清楚。由试验可知，MPBs 对巨噬细胞的胞内RNA 具有表达量上调作用，并对细胞因子具有双向调节作用，而关于MBPs 是如何通过受体信号途径调节细胞免疫的，还需进一步的研究。MBPs促进巨噬细胞增殖和巨噬细胞活性，抑制LPS 对巨噬细胞的损害，说明其对巨噬细胞具有增强其活力及免疫能力的作用，而对细胞不产生毒性。今后可进行巨噬细胞培养的体外试验，以探究其它免疫作用。

4 结论

研究MBPs 对巨噬细胞增殖、糖原、核酸、ATPase、LZM、SOD 及细胞因子的影响。研究发现：在设计浓度范围，MBPs 对巨噬细胞无毒副作用，并具有一定的促进作用；低浓度MBPs 对巨噬细胞糖原影响较小，而高浓度MBPs 对巨噬细胞内糖原影响较大；随着MBPs 浓度增高，核内DNA 及胞质内RNA 的染色程度逐渐增加，细胞活性逐渐增强；当MBPs 质量浓度为100 μg/mL 和200 μg/mL 时，ATPase 活力较空白组差异显著，MBPs 可缓解LPS 对ATPase 活性的抑制，此作用显著，且与浓度正相关；MBPs 质量浓度大于50 μg/mL 时对巨噬细胞内LZM 的含量呈显著的促进作用，可以缓解LPS 对LZM 含量的降低作用，此种作用与MBPs 浓度正相关；MBPs 质量浓度在100 μg/mL以上，对巨噬细胞酶内SOD 活性和缓解LPS 的刺激作用有显著的效果；MPBs 可以上调巨噬细胞促炎性细胞因子的表达，并可下调LPS 诱导的巨噬细胞促炎性因子的分泌，从而达到调节机体免疫力的作用。MBPs 影响巨噬细胞免疫活性的具体机制有待进一步研究。