布鲁氏菌病合并脊柱炎和关节炎的疼痛分值与血清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-4和IL-2的变化特点①

庞 盼 张 甜 关建萍 张峰波 扈会整 彭巧君

(陕西省核工业二一五医院检验科，咸阳 712000)

布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)感染引起的呈世界范围分布的人畜共患传染性疾病[1]。流行病学调查发现，全球布病发病率约为2.93/10万人，而我国仅在2012年布病发病率已高达3.11/10万人，且呈现逐年增长趋势[2，3]。新疆是我国的五大牧区之一，统计结果显示，2014年新疆布病的发病率达33.02/10万人，而2015～2016年新疆布病的发病率高达33.50/10万人，是目前新疆疾病防控的重点之一[4-6]。布鲁氏菌属于革兰阴性胞内寄生菌，人主要通过疤痕和皮肤上的伤口及吸入被污染的空气等感染布鲁氏菌[7]。人感染布鲁氏菌后多表现为骨关节和脊柱受累[8-10]。Ebrahimpour等[11]在研究伊朗地区布病流行时发现，350例布病患者发生骨关节受累的概率为75.4%。Jia等[12]在研究新疆布病流行特点时发现，81.0%的布病患者均出现骨关节疼痛症状。Li和Paul等[13]研究指出，当布病患者出现脊柱受累时，77%的患者会出现局灶性终板破坏，严重影响患者的生活质量。

有学者认为布鲁氏菌的感染与免疫系统中的免疫细胞和免疫分子的功能改变密切相关[14-16]。Li和Paul等[17,18]研究发现，在布鲁氏菌感染过程中，Th1细胞分泌的IFN-γ和IL-2水平降低，而Th2细胞分泌的IL-4水平增高，影响Th1/Th2型细胞因子模式向Th2方向漂移，不利于宿主产生有效的免疫应答，导致布鲁氏菌发生免疫逃逸。Im、Zhang和Lundtoft等[19-21]研究发现，当患者被布鲁氏菌、艾滋病毒和结核杆菌感染时，炎性因子IL-6和TNF-α的水平增高，宿主的炎性反应加强。但当布病患者出现脊柱炎和关节炎等并发症时，不同疼痛分值所对应的患者IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-4和IL-2水平目前并不清楚。本研究通过对2016年2月～2017年12月新疆布病流行情况、人口学分布、临床特征和疼痛分值进行回顾性分析，并检测了不同疼痛分值时患者的细胞因子水平，分析其临床特点，为布病的诊治提供新的观察指标。

1 资料与方法

1.1资料 选取新疆维吾尔自治区传染病医院2016年2月～2017年12月入院的307例布病患者(其中104例脊柱炎、133例关节炎、70例既有脊柱炎又有关节炎)治疗前的血标本作为病例组，同时选取100例新疆维吾尔自治区传染病医院的健康职工的血标本作为正常对照组。所有研究对象均需填写知情同意书，实验经新疆医科大学第一附属医院伦理学委员会批准(20150225-94)。布病的纳入标准根据我国2012年颁布的《布鲁氏菌病诊疗指南(试行)》标准[22]:有明确的流行病学史、有典型的临床表现(发热、乏力、多汗、骨关节疼痛，肝、脾、淋巴结和睾丸肿大等)、琥红平板凝集实验阳性、试管凝集实验(Serum agglutination test，SAT)滴度1∶100及以上(或病程1年以上者滴度为1∶50及以上；或半年内有布鲁氏菌疫苗接种史者，滴度虽然达1∶100 及以上，2～4周后应再查，滴度升高4倍及以上)或菌培养阳性，病程在6个月以内痊愈为急性期，超过6个月仍未痊愈为慢性期。排除伤寒、副伤寒、风湿热及结核、败血症等疾病。

1.2方法

1.2.1疼痛评分工具的选择 采用面部表情量表(Wong-Banker)[23]，即面部表情疼痛评分量表(Faces pain scale，FPS)和数字评分法(Numeric rating scale，NRS)[24]与词语相结合制成评估尺[25]。评估人员依据患者疼痛时呈现的面部表情来评估。疼痛分值用0～10共11个数字表示，“0”即为无疼痛，“10”即为最剧烈的疼痛。交由研究对象选择一个数字，这个数字就是代表患者自身的疼痛程度，或由评估者询问研究对象疼痛的严重程度，并根据研究对象的自述，选择相应的数字。根据疼痛量表对应标注的数字，将疼痛评分划分为4个不同的程度:“0”即为无痛，“1～3”即为轻度程度的疼痛，“4～6”即为中度程度的疼痛，“7～10”即为重度程度的疼痛。

1.2.2样本处理及细胞因子微球检测技术(Cytometric bead array，CBA)检测 收集所有研究对象的全血标本，放置离心机内3 000 r/min离心20 min，用移液枪将血清分装至1.5 ml的Ep管中，若不能及时检测，将样本放置-80℃冰箱保存。采用CBA技术检测布病患者在不同疼痛分值下血清中IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4和IL-6的水平(Human Th1/Th2-ⅡPE Detection Reagent，BD 公司)，将标准品按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256梯度稀释，实验步骤严格按照试剂盒说明书操作，用流式细胞仪分析读取数据(流式细胞仪为BD公司产品)，根据标准曲线计算样本中IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4和IL-6的浓度值。

2 结果

2.1流行病学特点 从新疆布病的流行病学特点对纳入本研究的布病患者资料进行分析总结，结果显示新疆布病主要在3～5月高发，主要感染人群为牧民，其最主要的感染途径是牛羊养殖和接触史，试管凝集实验滴度多为1∶100及以上，见表1。

2.2人口学分布特征 从新疆布病的人口学分布特征对纳入本研究的布病患者资料进行分析总结，结果显示布病患者男性多于女性，发病年龄主要集中在40～49岁，汉族发病率最高，其次为维吾尔族、回族、哈萨克族、锡伯族、东乡族和蒙古族，见表2。

2.3临床特征 从新疆布病的临床特征对纳入本研究的布病患者资料进行分析总结，结果显示布病患者主要以发热(体温38～38.9℃，以波浪热型最为典型)、乏力、多汗、肝脾淋巴结肿大、骨关节炎和脊柱炎为主，少数患者会出现神经系统损害、心血管系统损害、睾丸炎等并发症，见表3。

表1 新疆布病患者的流行病学特点(n=307)

Tab.1 Epidemiological characteristics of brucellosis in Xinjiang(n=307)

GroupsClassificationn(%)Incidence monthJanuary to February54(18)March to April156(51)June to September67(22)October to December30(9)Popular areasChangji Hui Autonomous Prefecture77(25)Tacheng41(14)Ili Kazakh Autonomous Prefecture35(11)Aksu24(8)Altay23(7)Bayin Guoyu Mongolian Autonomous Prefecture21(7)Kashgar19(6)Hetian14(5)Bortala Mongolian Autonomous Prefecture15(5)Hami13(4)Turpan13(4)Urumqi12(4)Career distributionHerder140(46)Self-employed persons33(11)worker21(7)veterinary15(5)student18(6)Faculty9(3)Civil servant9(3)chef12(4)driver16(5)retiree17(5)Unemployed17(5)History of infectionCattle and sheep breeding and exposure history264(86)Eating uncooked meat and dairy history31(10)No clear history of infection12(4)SAT 1∶5018(6)1∶10080(26)1∶200113(37)1∶40096(31)

2.4疼痛分值 本研究根据布病患者的临床特征将病例组分为脊柱炎组、关节炎组和既有脊柱炎又有关节炎组，通过3组研究对象对疼痛的自述，根据疼痛量表对应标注的数字，将疼痛评分划分为3个不同的程度。统计结果发现，布病患者合并脊柱炎出现重度疼痛的占55%，布病患者合并关节炎出现重度疼痛的占57%，而既有脊柱炎又有关节炎的布病患者出现重度疼痛的占33%，见表4。

2.5不同疼痛分值的布病合并脊柱炎患者组细胞因子的变化特点 本研究通过CBA法检测出布病合并脊柱炎患者疼痛分值为“1～3”，“4～6”，“≥7”时细胞因子的水平，发现与正常对照组相比，布病合并脊柱炎患者中IFN-γ和IL-2的水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。疼痛分值为“1～3”、“4～6”和“≥7”时，细胞因子IFN-γ和IL-2水平无明显变化，差异没有统计学意义(P>0.05)；且布病合并脊柱炎患者疼痛分值越高，TNF-α、IL-6和IL-4的水平也越高，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表5、图1。

2.6不同疼痛分值的布病合并关节炎患者组细胞因子的变化特点 本研究通过CBA法检测出布病合并关节炎患者疼痛分值为“1～3”、“4～6”和“≥7”时细胞因子的水平，发现与正常对照组相比，布病合并关节炎患者中IFN-γ和IL-2的水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。疼痛分值为“1～3”、“4～6”和“≥7”时，细胞因子IFN-γ和IL-2水平无明显变化，差异没有统计学意义(P>0.05)；且布病合并关节炎患者疼痛分值越高，TNF-α、IL-6、IL-4的水平也越高，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表6、图2。

表2 新疆布病患者的人口学分布特征(n=307)

Tab.2 Demographic distribution characteristics of brucello-sis in Xinjiang(n=307)

GroupsClassificationn(%)GenderMale patient255(83)Female patient52(17)Age (Average,y)4-9 16(5)10-19 14(5)20-29 23(7)30-39 50(16)40-49 126(41)50-59 58(19)60-69 13(4)70-79 5(2)≥80 2(1)EthnicityHan120(39)Uighur54(17)Hui45(15)Kazakh29(9)Xibo37(12)Dongxiang14(5)Mongolian8(3)

表3 布病患者的临床特征(n=307)

Tab.3 Clinical characteristics of patients infected withBrucella(n=307)

GroupsClassificationn(%)Fever36℃0(0)37-37.9℃94(31)38-38.9℃144(47)≥39℃69(22)WeakYes266(87)No41(13)Excessive sweatYes184(60)No123(40)Weight lossYes147(48)No160(52)Lymph node enlargementYes213(69)No94(31)HepatosplenomegalyYes170(55)No137(45)Joint painYes239(78)No68(22)Spinal painYes223(73)No84(27)Liver damageYes101(33)No206(67)Nervous system damageYes11(4)No296(96)Cardiovascular system injuryYes9(3)No298(97)OrchitisYes14/255(5)No241/255(95)Other complicationsYes49(16)No258(84)

表4 布病患者疼痛分值

Tab.4 Pain score of patients infected with Brucella

GroupsPain scoreDegree of painn(%)Spondylitis(n=104)1-3Mild23(22)4-6Moderate24(23)≥7Severe57(55)Arthritis(n=133)1-3Mild24(18)4-6Moderate33(25)≥7Severe76(57)Both spondylitis and arthritis(n=70)1-3Mild12(17)4-6Moderate14(20)≥7Severe44(63)

图1 布病合并脊柱炎患者不同疼痛分值细胞因子水平Fig.1 Levels of cytokines in brucellosis patients with spondylitis complications under different painscoreNote: A.The level of IFN-γ for different pain scores；B.The level of TNF-a for different pain scores；C.The level of IL-6 for different pain scores；D.The level of IL-4 for different pain scores； E. The level of IL-2 for different pain scores.Compared with normal control,**.P<0.01；"1-3 score" compared with "4-6 score",##.P<0.01；"4-6 score" compared with "≥7 score",▲▲.P<0.01.

表5 不同疼痛分值的布病合并脊柱炎患者细胞因子水平

Tab.5 Levels of cytokines in brucellosis patients with spondylitis complications under different pain score

GroupsPain scoreIFN-γTNF-αIL-6IL-4IL-2Spondylitis1-34.83±1.0713.57±2.8216.63±4.8214.20±2.991.24±0.244-65.44±1.1219.16±5.622)21.02±5.582)18.09±5.202)1.20±0.22≥75.43±1.9326.36±6.343)29.09±3.653)22.22±5.033)1.30±0.19Normal control9.97±2.421)4.32±0.971)3.02±1.331)3.22±1.131)6.39±1.021)

Note：Compared with the spondylitis group,1)P<0.01；"1-3 score" compared with "4-6 score",2)P<0.01； "4-6 score" compared with "≥7 score",3)P<0.01.

表6 布病合并关节炎患者不同疼痛分值细胞因子水平

Tab.6 Levels of cytokines in brucellosis patients with arthritis complications under different pain score

GroupsPain scoreIFN-γTNF-αIL-6IL-4IL-2Arthritis1-35.97±1.8310.32±2.686.79±2.2411.40±4.182.37±0.464-65.69±1.2113.21±3.642)19.99±6.712)14.88±3.972)2.04±0.36≥75.47±0.9429.16±5.363)28.42±4.613)19.30±4.993)2.10±0.50Normal control9.97±2.421)4.32±0.971)3.02±1.331)3.22±1.131)6.39±1.021)

Note：Compared with the arthritis group,1)P<0.01； "1-3 score" compared with "4-6 score"，2)P<0.01； "4-6 score" compared with "≥7 score"，3)P<0.01.

表7 布病患者既有脊柱炎又有关节炎时不同疼痛分值细胞因子水平

Tab.7 Levels of cytokines in brucellosis patients with spondylitis and arthritis complications under different pain score

GroupsPain scoreIFN-γTNF-αIL-6IL-4IL-2Spondylitis and arthritis1-35.28±0.7521.24±6.6719.54±5.8519.71±4.902.89±0.474-65.74±0.9727.03±5.632)25.30±5.862)23.04±5.372)2.49±0.51≥75.49±0.9332.79±5.403)44.77±6.563)29.57±4.023)2.64±0.14Normal control 9.97±2.421)4.32±0.971)3.02±1.331)3.22±1.131)6.39±1.021)

Note：Compared with the spondylitis and arthritis group,1)P<0.01； "1-3 score" compared with "4-6 score"，2)P<0.01； "4-6 score" compared with "≥7 score"，3)P<0.01.

图3 布病患者既有脊柱炎又有关节炎时不同疼痛分值细胞因子水平Fig.3 Levels of cytokines in brucellosis patients with spondylitis and arthritis complications under different pain scoreNote: A.The level of IFN-γ for different pain scores；B.The level of TNF-α for different pain scores；C.The level of IL-6 for different pain scores；D.The level of IL-4 for different pain scores； E.The level of IL-2 for different pain scores.Compared with normal control,**.P<0.01；"1-3 score" compared with "4-6 score",##.P<0.01；"4-6 score" compared with "≥7 score",▲▲.P<0.01.

2.7不同疼痛分值的布病患者既有脊柱炎又有关节炎时细胞因子的变化特点 本研究通过CBA法检测出布病患者既有脊柱炎又有关节炎且疼痛分值为“1～3”、“4～6”和“≥7”时细胞因子的水平，发现与正常对照组相比，布病患者既有脊柱炎又有关节炎时IFN-γ和IL-2的水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。疼痛分值为“1-3”、“4-6”和“≥7”时，细胞因子IFN-γ和IL-2水平无明显变化，差异没有统计学意义(P>0.05)；且布病患者既有脊柱炎又有关节炎时疼痛分值越高，TNF-α、IL-6和IL-4的水平也越高，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表7、图3。

3 讨论

布病是一种呈世界性分布的传染病，该病在以畜牧业为主的国家和地区较为常见[26，27]。由于新疆是布病流行的重灾区，因此对布病的深入研究就显得尤为重要，本研究通过收集、整理、分析明确诊断为布病的患者临床资料发现，新疆布病流行特点主要以3～5月为发病高峰期，男性患者多于女性，主要感染人群为牧民，这一结果与Lou、Muhetaer和Zhang等[28-30]研究中国新疆布病流行特点的报道相一致。 布病的感染者大多为青壮年男性，感染人群主要为牛羊养殖者、兽医、加工病畜皮毛的工人、屠宰场的工人、销售加工病畜乳制品和肉类的工人，其次为饮用病畜未煮熟的肉类和奶制品的人群等，涉及各个行业和领域，故患病率明显增高。

免疫系统是体内最重要的防御系统，适当的免疫调控可以有效地保护机体免受病原体的侵害，而当机体的免疫调控异常时可能会导致免疫系统功能紊乱，出现免疫功能过强的高免疫反应或免疫功能减弱的低免疫反应，形成超敏反应或肿瘤及病原体免疫逃逸，发挥重要的双向作用。布鲁氏菌属于革兰阴性胞内寄生菌，感染宿主后，巨噬细胞会发挥相应的免疫应答对体内的异物布鲁氏菌进行清除，但从布病患者的发病情况来看，巨噬细胞发挥的免疫攻击作用并不能有效地将宿主体内的布鲁氏菌彻底清除。残存的布鲁氏菌通过不断刺激宿主免疫细胞活化，导致宿主体内形成复杂的免疫细胞及分子网络，最终造成免疫功能发生紊乱[31,32]。本研究通过分析不同疼痛分值时布病合并脊柱炎、关节炎患者血清中IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-4和IL-2的水平，发现与正常对照组相比，布病合并关节炎和脊柱炎患者中IFN-γ和IL-2的水平明显降低，当布病患者疼痛分值改变时，IFN-γ和IL-2的水平无明显变化，我们认为，在布鲁氏菌感染过程中存在Th1细胞因子水平的降低，宿主的免疫保护功能减弱，并且当布病患者疼痛分值改变时，Th1细胞的免疫功能不受影响。本研究结果还显示，与正常对照组相比，布病合并脊柱炎和布病合并关节炎患者中TNF-α、IL-6和IL-4的水平增高，且患者疼痛分值越高，细胞因子的水平也越高；当布病患者既有脊柱炎又有关节炎时，TNF-α、IL-6和IL-4的水平随着疼痛分值的增高而增加的幅度更大。我们认为当布鲁氏菌感染宿主时，Th2细胞的负性调控作用增强，分泌的相应细胞因子IL-4增高，出现偏向Th2细胞的Th1/Th2细胞因子的免疫失衡，不利于布鲁氏菌被宿主体内的免疫细胞有效清除；而TNF-α和IL-6的水平随着疼痛分值的增高而增高，我们推测在布鲁氏菌感染出现关节炎和脊柱炎等并发症时，TNF-α和IL-6的水平越高，患者体内的炎性反应越强，疼痛程度增加，并发症增多，易出现多系统多器官受累的症状。综上所述，本研究发现，布病合并脊柱炎和关节炎患者疼痛分值越高，患者血清中TNF-α、IL-6和IL-4的水平也越高，因此在临床医护工作中，可以预见性的检测血清中TNF-α、IL-6和IL-4这3种细胞因子，并积极地对患者采取针对性的治疗与护理，帮助患者得到及时的治疗，促进康复。