补肾活血方对URSA患者外周血中IL-12和IFN-γ影响的临床研究①

冯晓玲 贾 丹 刘庆丽 张 杨

(黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 150040)

复发性流产是指与同一个配偶连续发生2次及以上的自然胚胎丢失或停止发育[1]。本病的病因复杂，除遗传因素、子宫畸形和子宫肌瘤等解剖学因素、内分泌因素、生殖道感染因素、免疫因素、血栓形成倾向以及环境因素外，另外还有大约40%的患者病因不明，称为不明原因复发性流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)[2]。随着对本病认识的深入，研究发现免疫因素是导致URSA发生的直接因素，其中Th1/Th2失衡是导致本病发生的主要原因[3]。祖国医学对本病有了更深入的认识，补肾活血法治疗URSA患者也取得了显著的临床疗效，本文通过临床研究,探讨补肾活血方对URSA患者外周血中IL-12和IFN-γ的影响。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1URSA患者 2016年2月～2017年2月期间就诊于黑龙江中医药大学附属第一医院URSA患者61例作为研究对象，排除患有精神疾病不能完成治疗及患有肝肾功能异常、风湿等全身系统疾病，两组病例年龄及孕周比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。患者年龄23～41岁，平均年龄(30.75±4.02)岁，停经周数为6～8周。分为补肾活血方联合地屈孕酮31例(URSA-1)，其中治疗期间1例未按要求治疗，和单用地屈孕酮30例(URSA-2)。

1.1.2URSA妊娠失败患者 2016年2月～2017年2月期间就诊于黑龙江中医药大学附属第一医院的URSA妊娠失败患者15例作为实验组(URSA-3),纳入标准为年龄22～42岁，妊娠<12周者，符合早期URSA西医诊断标准及中医肾虚血瘀证证候诊断标准而未经任何治疗URSA流产者。排除标准为不符合纳入病例标准者，如胚胎染色体核型分析异常和病因明确者。患者年龄23～40岁，平均年龄(32.33±4.74)岁，停经周数为6～10周，正常妊娠人工流产患者15例作为对照组(Control)，纳入标准为患者年龄和妊娠周数同上并且为正常妊娠，无自然流产史，有一次或一次以上正常生育史，既往生育子女均健康，夫妻无遗传病史，此次妊娠状况良好，实验室指标及超声正常，要求进行人工流产患者。排除标准为首次妊娠妇女；有保胎意愿；胚胎染色体核型分析异常者；实验室指标及超声有异常者。年龄29～41岁，平均(33.80±3.74)岁，孕周范围为6～10周。本研究已获得伦理委员会批准，并在获得患者知情同意后，收集患者蜕膜组织。

1.2方法

1.2.1给药方式 URSA-1患者给予补肾活血方联合地屈孕酮口服治疗4周。URSA-2患者单独给予地屈孕酮口服治疗4周。中药补肾活血方，药物如下:丹参15 g，菟丝子15 g，续断15 g，桑寄生15 g，阿胶(烊化)10 g，黄芪15 g。根据患者情况随证加减，日一剂200 ml水煎服，早晚分服，以上中药汤剂均由黑龙江中医药大学附属第一医院中药局及煎药室提供。地屈孕酮片:10 mg，口服2次/d，从住院开始服用，服用4周。地屈孕酮片(达芙通，荷兰Abbott Healthcare Products BV公司)国药准字H20130110，规格10 mg/片。

1.2.2ELISA检测 URSA-1组和URSA-2组患者入组前以及入组4周后均采血，统一应用ELISA法检测患者血清中IL-12、IFN-γ的水平。使用Human IL-12 ELISA试剂盒和Human IFN-γ ELISA kit试剂盒(江苏科特生物科技有限公司)，具体操作步骤均按照试剂盒步骤进行。

1.2.3RT-PCR检测 分别收集URSA-3组和Control组早孕期妇女行人工流产的蜕膜组织，用RT-PCR方法检测两组患者蜕膜组织中的IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、IFN-γR mRNA的表达量。TRizol购自Invitrogen公司，M-MLV Reverse Transcriptase购自Promega公司。RT-PCR使用2×SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒(BIOTOOL)。具体操作步骤按照说明书进行。实验结果采用比较Ct法定量，2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。ΔCt =Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt待测样品-ΔCt对照组。将逆转录得到的完整cDNA模板进行RT-PCR扩增，以此设定的程序运行RT-PCR仪，由此得出扩增曲线。

1.2.4妊娠结局与随访情况比较 截止2018年1月，剔除本研究中脱落的患者，对其余患者进行电话随访调查，URSA-1组有1例患者在妊娠32周左右时产检发现胎盘老化住院治疗，治疗后分娩一名健康胎儿；2例患者在妊娠14周左右出现阴道流血不止，发生难免流产，胎儿做染色体核型分析均未见异常。余皆无明显不适，分娩健康胎儿中，Apgar评分8～10分。URSA-2组有3例患者妊娠14周左右，发现胎儿停止发育，妊娠约12周；2例患者妊娠15周左右出现阴道流血量增多，腹痛不止，发生难免流产；3例患者妊娠21周左右行超声检查，发现无胎心，胎儿做染色体核型分析均未见异常；余皆分娩健康胎儿，Apgar评分8～10分。

2 结果

2.1URSA-1组和URSA-2组患者血清中IL-12、IFN-γ的水平

2.1.1外周血中IL-12标准曲线 ELISA法测定两组临床患者血清中IL-12水平，与标准品对照后吸光度曲线如图1、表1所示。

2.1.2外周血中IFN-γ标准曲线 ELISA法测定两组临床患者血清中IFN-γ水平，与标准品对照后吸光度曲线如图2、表2所示。

2.2URSA-3组和Control组患者流产蜕膜组织中IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、IFN-γR组扩增曲线 我们通过RT-PCR法测定URSA组与Control组流产蜕膜组织中IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、IFN-γR的含量，使用软件绘制出各项观测指标的扩增曲线(图3、4)。

GroupsnBefore treatmentAfter treatmenttPURSA-13041.65±11.4532.52±9.071)12.1010.000URSA-23043.82±11.70 37.71±10.472)3)10.2000.000

Note：Compared with the URSA-1 before treatment,1)P<0.01；compared to the URSA-2 before treatment,2)P<0.01；compared with the URSA-1 after treatment,3)P<0.01.

图2 URSA-1组和URSA-2组患者血清中IFN-γ水平曲线图Fig.2 Serum IFN-γ level curve in URSA-1 group and URSA-2 group patients

GroupsnBefore treatmentAfter treatmenttPURSA-13037.87±9.4727.92±7.641)3.9030.000URSA-230 39.68±10.1233.08±8.892)3)2.7450.000

Note：Compared with the URSA-1 before treatment,1)P<0.01；compared to the URSA-2 before treatment,2)P<0.01；compared with the URSA-1 after treatment,3)P<0.01.

图3 URSA-3组和Control组患者流产蜕膜组织中IL-12Rβ1、IL-12Rβ2和IFN-γR扩增曲线Fig.3 Amplification curves of IL-12Rβ1，IL-12Rβ2 and IFN-γR in decidua tissue of abortion in URSA-3 group and Control groupNote: nt is the control group,ut is the URSA group.

图4 GAPDH扩增曲线Fig.4 GAPDH amplification curvesNote: nt is the control group,ut is the URSA group.

表3 URSA-3组与Control组蜕膜组织中IL-12Rβ1、IL-12 Rβ2和IFN-γR mRNA相对表达量

Tab.3 Relative expression of IL-12Rβ1，IL-12Rβ2 and IFN-γR mRNA in decidua tissues of URSA-3 group and Control group

GroupsnIL-12Rβ1 mRNAIL-12Rβ2 mRNAIFN-γR mRNAControl150.69±0.270.59±0.160.62±0.16URSA-3151.81±0.291.13±0.250.99±0.22P0.0000.0070.000

表4 URSA-1组和URSA-2组临床妊娠结局比较

Tab.4 Total clinical efficacy of URSA-1 group and URSA-2 group

GroupsnLive birth babyabortionTotal effective rate(%)URSA-13028293.3URSA-23022873.3

2.3URSA-3与Control组蜕膜IL-12Rβ1、IL-12β2、IFN-Rγ mRNA表达比较 两组URSA患者的蜕膜组织中，URSA-3组中IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、IFN-Rγ mRNA表达均高于Control组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.4妊娠结局及随访情况比较 总疗效如表4所示，两组相比临床保胎成功率差异具有显著统计学意义(P<0.05)，说明URSA-1组与URSA-2组相比，临床疗效更好。

3 讨论

近年来生殖免疫学的研究越来越深入，免疫因素在生殖中发挥着至关重要的作用，而且发现URSA的发生可能与母胎界面间免疫耐受机制相关，是免疫排斥的结果。URSA这种病理性妊娠可能是因为细胞因子的分泌异常或者母胎界面局部细胞功能异常引起的。

正常妊娠期，母体的各项机能都会发生相应变化，尤其是免疫功能方面，包括特异性的免疫抑制、抑制性T细胞和非特异性因子维持正常妊娠。这种环境一旦被打破，母体就会对胎儿产生免疫排斥，进而可能引起妊娠失败[4,5]。近年来，学者们对URSA的生殖免疫学因素进行了诸多研究，发现与免疫相关的复发性流产可以分为自身免疫型和同种免疫型，同种免疫型又称原因不明型。同种免疫型URSA与母胎界面免疫耐受不平衡具有相关性，同种免疫型URSA的原因包括Th1与Th2细胞因子的失衡、封闭抗体低下、NK细胞活性及亚型表达异常、CD4+CD25+调节性T淋巴细胞表达异常等。调节性T细胞是一类具有免疫抑制功能的T细胞亚型,表达CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的亚型起源于胸腺[6]，在机体的免疫耐受和调控免疫应答中发挥不可忽视的作用[7]。妊娠期间胎儿所携带的抗原能够被母体的抗原呈递细胞所识别，并呈递给特定的CD4+T细胞，CD4+T细胞受到刺激后分化为Th1、Th2、Th17和调节性T细胞，从而在母胎界面形成特定的免疫微环境。Th1型细胞因子主要介导细胞免疫反应,产生胚胎排斥作用；Th2细胞因子主要促进抗体生成和介导体液免疫，起到抗炎性反应的作用，对Th1细胞有抑制作用，故对妊娠有利。Th1/Th2细胞因子网络调控这两种免疫应答，其过程和方式错综复杂。相关文献报道，流产的发生与Th1/Th2的偏移密切相关，正常妊娠需要Th1/Th2保持平衡，打破这种平衡，将导致URSA的发生[8,9]。Th1型细胞主要分泌IL-2、 IL-12、TNF-α等细胞因子，Th2型细胞主要分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、IL-4、 IL-6等因子[10]。

IL-12是一种由淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和其他抗原呈递细胞产生的通过二硫键将分子量35 kD(P35)和40 kD(P40)两个亚基结合组成的一种细胞因子，是白介素家族中的一员。IL-12与其受体(IL-12Rβ1和IL-12Rβ2两个链构成的异二聚体)之间具有很高的亲和力。P40亚单位是可溶性的蛋白，且为诱导性表达，与免疫细胞表面对应的受体IL-12Rβ1相结合；而P35亚基为组成性低水平表达，与对应的受体IL-12Rβ2相结合并产生免疫传导信号。IL-12有多种生物活性，在机体炎性反应早期和感染时期即可产生，其中最主要的生物学特性是调节Th细胞亚群的平衡。IL-12是连接抗原特异适应性免疫与先天免疫应答的关键因子，在细胞免疫应答的过程中起调节作用，并且可以诱导细胞免疫排斥反应。国内外研究证明，IL-12水平的异常与URSA的发生具有相关性[11,12]。

研究者在1965年发现白细胞培养上清液中有IFN样抗病毒物质，另一团队在1973年于淋巴细胞培养上清液中也发现干扰素存在，1980年将其命名为IFN-γ。IFN-γ主要由活化的T细胞及NK细胞产生，亦属于Th1型细胞因子，可以抑制Th2细胞增生。相关研究证明，URSA患者外周血中IFN-γ水平相比于正常未孕妇女明显升高。IFN-γ导致流产可能通过以下多种途径，一方面促进Th0向Th1细胞分化，激活 NK细胞的杀伤毒性；另一方面，能够促进免疫应答反应，使胎盘细胞发生凋亡，同时能促使滋养细胞表面黏附分子的表达，损伤滋养细胞的生长发育[13,14]。

本研究结果表明，URSA患者蜕膜组织中IL-12R及IFN-γR的含量明显高于正常早孕人流组。说明二者的异常表达可能通过改变蜕膜组织中细胞因子的作用，进一步影响母胎界面免疫耐受及Th1/Th2的平衡，导致流产[15，16]。提示IL-12、IFN-γ可能与URSA的发病相关。用ELISA法对分别用补肾活血方联合地屈孕酮及单纯地屈孕酮治疗的两组URSA患者治疗前后外周血中的IL-12、IFN-γ水平进行测定，结果发现，治疗后URSA患者外周血中IL-12、IFN-γ水平明显降低，并且补肾活血方及地屈孕酮联合用药疗效明显优于单纯地屈孕酮组，为补肾活血治疗URSA临床应用提供了参考依据。

本实验检测蜕膜组织IFN-γR和IL-12R mRNA表达水平,今后我们的研究方向应增加检测治疗前外周血中IL-12与IFN-γ水平的临床部分，并分析细胞因子与蜕膜组织靶细胞膜表面相关受体作用的相关性。同时扩大样本量，减少地域因素带来的影响，以达到减少误差的效果，并进行多因素分析，设计相关的动物实验，深入研究蜕膜组织中的IL-12、IFN-γ水平及导致URSA的机制，弥补不足。对患者进行远期随访，完善儿童智力、生长发育状况等方面的资料，为补肾活血方长期广泛应用于临床治疗URSA提供依据。