北五味子多糖的分离纯化及其对鸡外周血淋巴细胞的影响

董雯雯 林树乾 李桂明 赵增成 黄中利 傅剑 殷斌 刘月月 贾凤娟 杨世发

摘要：本研究在传统水提醇沉法基础上辅以酶消化法提取北五味子多糖，并用离子凝胶柱层析法对其进一步纯化，分离得到三种分子量的多糖组分（SCP-Ⅰ、SCP-Ⅱ和SCP-Ⅲ）。为分析多糖三种组分对鸡外周血淋巴细胞的作用，首先用高浓度（最高10 mg/mL）的三种多糖组分作用于淋巴细胞，结果显示≤1 mg/mL的多糖對细胞没有显著的毒性作用。以不同浓度的三种SCP组分（0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1 600.0μg/mL）作用于淋巴细胞，发现SCP-Ⅲ对细胞因子IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌具有显著的增强作用，但最佳作用浓度不同，SCP-Ⅰ和SCP-Ⅱ对这三种细胞因子的作用效果不显著。本研究为北五味子多糖的精制和应用奠定了理论基础。

关键词：北五味子;多糖;分离纯化;鸡;淋巴细胞;细胞因子

中图分类号：S853.7文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）07-0117-04

五味子为木兰科五味子[Schisandra chinensis（Turcz.） Baill]的干燥成熟果实，是我国传统中草药，含有木脂素、多糖、挥发油等多种活性成分，其多糖成分具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗疲劳和抗肿瘤等多种生物活性[1-3]。五味子资源丰富，其中北五味子中的多糖含量比南五味子丰富，其水提得率高达10%以上[4，5]，具有多糖提取应用的基础。

五味子多糖（Schisandra chinensis polysaccharide， SCP）的体外活性研究发现，SCP可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性，促进脾细胞的增殖，提高免疫抑制小鼠的淋巴细胞活性[6]。初步药理研究表明，SCP作用于正常小鼠，可增加免疫器官指数，增强网状内皮系统对India Ink的吞噬能力，并显著提高正常小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率，促进淋巴细胞转化[7];SCP作用于免疫抑制小鼠，能显著对抗环磷酰胺（CTX）所致小鼠外周血白细胞的减少，拮抗由环磷酰胺引起的T淋巴细胞增殖抑制，并增加免疫抑制小鼠胸腺和脾脏重量，具有显著的免疫增强作用[8，9]。

本研究对北五味子进行提取、分离、纯化，将分离到的多糖组分作用于鸡外周血淋巴细胞，分析其对鸡外周血T淋巴细胞活性和细胞因子的影响，为该多糖的进一步应用和研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究对所用北五味子购自济南建联中药店;无特定病原（SPF）鸡购自山东昊泰繁育有限责任公司;细胞因子检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司;CCK8购自索莱宝公司;RPMI1640细胞培养液和胎牛血清购自GIBCO公司;其它常用化学试剂为国产分析纯。

1.2 北五味子多糖的分离提取

北五味子多糖的提取采用传统水提醇沉法进行，并结合酶消化法除蛋白以提高多糖的提取效率[10]。具体步骤如下：用粉碎机将北五味子打磨成粉，用滤纸分成数包并放入索氏提取器中，乙醚抽提脂肪。将除去脂肪的北五味子粉与去离子水混合后加入胃蛋白酶充分反应，随后置于85℃浸提，并用0.1%的活性炭除色素杂质。静置沉淀后过滤，再离心取上清，用旋转蒸发仪加压浓缩。随后用无水乙醇沉淀粗多糖，将沉淀相继用乙醇、丙酮和乙醚洗涤，冷冻干燥后即得到粉末状北五味子多糖，最后采用苯酚-硫酸法检测所得SCP纯度[11]。

1.3 北五味子多糖的纯化

将上述提取的SCP重新溶解，取1 mL溶液沿管壁缓慢加入到已平衡好的Sephadex G-200凝胶柱（700 mm × 15 mm），以0.2 mL/min的流速用0.1 mol/L NaCl洗涤，每管收集间隔为5 min，用馏分自动收集器进行收集，将洗脱峰的洗脱液装入透析袋进一步浓缩（截流分子量为7 000 D），最后经乙醇沉淀，冷冻干燥得到纯化多糖组分。

1.4 鸡外周血淋巴细胞的分离与培养

采用成年SPF鸡一只，翅静脉采抗凝血1 mL，抗凝血与全血稀释液1∶1混匀后，缓慢加于2 mL细胞分离液的液面上，以4℃、1 500 r/min离心15 min，此时离心管中由上至下分四层：血浆液层、环状乳白色淋巴细胞、透明分离液层、红细胞层。收集第二层细胞放入含细胞洗涤液4～5 mL的试管中，充分混匀后，以1 500 r/min离心10～30 min。沉淀经反复洗2次即得所需淋巴细胞。台盼蓝检测细胞活力，然后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液将细胞稀释为1×106/mL，以每孔100μL接种到96孔板，置于37℃、5% CO2孵育培养。

1.5 多糖对淋巴细胞的毒性检测

淋巴细胞培养2 h后弃去上层培养液，加入混合不同浓度（0、10、100、1 000、5 000、10 000μg/mL）多糖组分的培养液孵育培养24 h，加入10μL CCK8溶液，继续培养1 h后在450 nm处测定吸光度，确定各多糖组分的毒性作用。

1.6 多糖对淋巴细胞分泌细胞因子的影响

淋巴细胞培养2 h后弃去上层培养液，加入混合不同浓度（0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1 600.0μg/mL）SCP的培养液孵育培养16～48 h至淋巴细胞铺满底部，取上清，用ELISA试剂盒检测上清中IFN-γ、IL-2和IL-6浓度。

2 结果与分析

2.1 北五味子多糖的分离提纯

采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，用标准葡萄糖系列溶液绘制标准曲线，以吸光度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，浓度与吸光度值呈良好的线性关系，回归方程为：y=0.014x，R2=0.9963。检测结果表明，北五味子多糖的提取率达到5.61%，多糖的纯度为91.18%。