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沙利度胺通过miR-29c-3p/TGIF2途径调控血管内皮细胞增殖凋亡的分子机制

2019-09-03尹希燕孙丽刘子忠刘伟宋加利刘旋

中国老年学杂志 2019年17期
关键词:沙利度胺荧光素酶内皮细胞

尹希燕 孙丽 刘子忠 刘伟 宋加利 刘旋

(滨州市第二人民医院 1老年医学科,山东 滨州 256800;2心内科;3心血管外科)

沙利度胺(thalidomide)又称反应停,研究发现其在一些进展性、难治性实体瘤和骨髓瘤的治疗中具有抗肿瘤活性,其抗肿瘤作用可能与抑制肿瘤血管生成有关〔1,2〕。同源异型结构域蛋白转化生长影响因子(TGIF)家族由 TGIF、TGIF2、TGIFLX和 TGIFLY组成〔3〕。TGIF2是TGIF家族中的重要成员,其在高糖作用下,人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中TGIF2低表达,在血管内皮损伤中发挥重要作用,上调 TGIF2 表达后,对高糖引起的血管内皮损伤有一定的改善作用〔4,5〕。miRNA在机体多种生理病理过程中的作用已得到普遍认可,包括调节血管生成〔6,7〕,如miR-34a能够通过下调TGIF2表达抑制HUVECs的增殖和迁移能力,促进其凋亡,从而促进血管内皮损伤〔8〕。但miR-29c-3p在血管生成中的作用及机制尚未清楚。本研究拟以HUVECs为研究对象,检测沙利度胺处理的HUVECs中miR-29c-3p、TGIF2的表达,观察过表达miR-29c-3p、抑制miR-29c-3p、过表达TGIF2、敲减TGIF2对沙利度胺处理的HUVECs增殖、凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料 HUVECs购自美国Lonza公司;DMEM培养基、胎牛血清、噻唑蓝(MTT)、胰蛋白酶均购自美国Sellect公司;LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自大连Takara公司;膜联蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司;聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自德国罗氏公司;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒、电化学发光法(ECL)发光液和放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液均购自碧云天公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2细胞培养 用含10 %胎牛血清的DMEM培养基培养HUVECs,置于37℃,5% CO2的培养箱中常规培养。

1.3细胞转染 将miR-29c-3p mimics、miR-NC、20 μg/ml沙利度胺+anti-miR-29c-3p、20μg/ml沙利度胺+anti-miR-NC、si-con、si-TGIF2、20 μg/ml沙利度胺+pcDNA、20 μg/ml沙利度胺+pcDNA-TGIF2按照脂质体LipofectamineTM2000说明书操作步骤转染至HUVECs,然后用20 μg/ml沙利度胺处理48 h,分别标记为miR-29c-3p mimics组、miR-NC组、沙利度胺+anti-miR-29c-3p组、沙利度胺+anti-miR-NC组、si-con组、si-TGIF2组、沙利度胺+pcDNA组、沙利度胺+pcDNA-TGIF2组,转染48 h后,用qRT-PCR检测转染效率。转染成功后,用于后续试验。

1.4qRT-PCR实验 取适量对数生长期1.3中各组细胞,遵照RNA抽提试剂盒说明书提取RNA,进行定量,然后按逆转录试剂盒按照说明书合成cDNA。最后按qRT-PCR试剂盒说明书进行miR-29c-3p、TGIF2检测。用2-△△Ct计算miR-29c-3p、TGIF2的表达。

1.5MTT实验 取适量1.3各组细胞,加入20 μl、5 g/L的MTT溶液,培养4 h,然后弃去上清,每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO),震荡,使结晶溶解,在490 nm波长下检测细胞吸光度(A)。细胞的增殖力与细胞活力呈正比。

1.6Annexin V-FITC/PI流式细胞术 将1.3各转染组细胞用结合缓冲液 500 μl悬浮细胞,分别加入5 μl Annexin V-/FITC和PI,混匀,室温避光静置15 min。采用流式细胞仪测定结果。细胞的凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。每个样品重复3次。

1.7Western印迹实验 收集1.3各组细胞,加入裂解液,冰上裂解30 min。12 000 r/min离心10 min,取上清置于EP管,加入5倍SDS上样缓冲液,沸水煮沸10 min。电泳后用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜;5%脱脂奶粉将膜封闭2 h,洗膜,加入Ⅰ抗,4℃过夜孵育,洗膜,加Ⅱ抗,4℃ 2 h。加发光液,曝光。

1.8双荧光素酶报告基因检测实验 取适量对数生长期1.3各组细胞,按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行操作,以psiCHECK2-TGIF2-3'UTR WT和psiCHECK2-TGIF2-3'UTR MUT的表达为对照,观察miR-29c-3p对TGIF2表达的影响。

1.9统计学处理 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1沙利度胺对血管内皮细胞miR-29c-3p表达、细胞增殖和凋亡的影响 与对照组相比,沙利度胺组miR-29c-3p表达显著升高,48、72 h细胞活性显著降低,细胞凋亡率显著升高(均P<0.05),见图1,表1。

图1 细胞凋亡流式图

表1 沙利度胺对血管内皮细胞miR-29c-3p表达、细胞增殖和凋亡的影响

2.2过表达miR-29c-3p对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响 与miR-NC组相比,miR-29c-3p组miR-29c-3p表达显著升高,48、72 h细胞活性显著降低,细胞凋亡率显著升高(P<0.05,P<0.01)。见表2。

表2 过表达miR-29c-3p对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

2.3抑制miR-29c-3p表达沙利度胺对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响 与沙利度胺+anti-miR-NC组相比,沙利度胺+anti-miR-29c-3p组miR-29c-3p表达显著降低,48、72 h细胞活性显著升高,细胞凋亡率显著降低(均P<0.05)。见表3。

表3 抑制miR-29c-3p表达沙利度胺对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

2.4miR-29c-3p靶向调控TGIF2表达 运用miRcode数据库预测到miR-29c-3p与TGIF23'UTR存在结合位点(图2);双荧光素酶活性检测结果显示,与miR-NC组(1.04±0.09)相比,miR-29c-3p组WT-TGIF2细胞中荧光活性(0.43±0.05)显著降低(t=10.262,P=0.001),WT-TGIF2细胞中荧光活性不受影响,两组MUT-TGIF2(1.01±0.08、0.97±0.08)差异无统计学意义(t=0.612,P=0.573);与miR-NC组(0.61±0.06)相比,miR-29c-3p组细胞中TGIF2表达(0.24±0.03)显著降低,与anti-miR-NC组(0.54±0.05)相比,anti-miR-29c-3p组(0.97±0.09)显著升高(均P<0.05),且4组差异有统计学意义(F=71.470,P=0.000),见图3。

图2 TGIF2的3'UTR中含有与miR-29c-3p互补的核苷酸序列

图3 TGIF2蛋白表达

2.5沙利度胺对血管内皮细胞中TGIF2表达的影响 与对照组(1.15±0.08、0.64±0.06)相比,沙利度胺组TGIF2 mRNA表达(0.47±0.05)显著降低(t=12.485,P=0.000),TGIF2蛋白表达(0.31±0.02)显著降低(t=9.037,P=0.001)。见图3。

2.6敲减TGIF2表达对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响 与si-NC组相比,si-TGIF2组TGIF2蛋白表达显著降低(图3),48、72 h细胞活性显著降低,细胞凋亡率显著升高(均P<0.05)。见表4。

2.7TGIF2过表达沙利度胺对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响 与沙利度胺+pcDNA组相比,沙利度胺+pcDNA-TGIF2组TGIF2蛋白表达显著升高,48、72 h细胞活性显著升高,细胞凋亡率显著降低(均P<0.05)。见图3,表5。

表4 敲减TGIF2表达对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

表5 过表达TGIF2沙利度胺对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

3 讨 论

大量研究证实,沙利度胺为血管生成的抑制剂,但其抗血管生成作用的机制尚未清楚〔9,10〕。Bauer等〔11〕报道,沙利度胺抑制大鼠主动脉的微血管形成,但在没有微粒体的情况下,沙利度胺对微血管形成或细胞增殖没有影响,证明沙利度胺的代谢物是其抗血管生成作用的原因。迟晓艳等〔12〕在血管内皮细胞的研究中报道,沙利度胺可抑制其增殖,促进凋亡并阻滞G0/G1期以抑制肿瘤的生长。本研究发现,沙利度胺可抑制HUVECs增殖,促进凋亡;进一步研究发现,沙利度胺可上调HUVECs中miR-29c-3p的表达。

研究显示,miRNA参与真核生物的病理生理过程,包括血管内皮的生成〔13〕及与血管相关疾病的进展〔14〕。Wang等〔15〕研究发现,过表达miR-126能降低棕榈酸诱导的HUVEC中活性氧(ROS)的产生、肿瘤坏死因子(TNF)-α表达和细胞凋亡,抑制miR-126则起到相反的作用,miR-126通过位于TNF(TRAF)7 mRNA的3'非翻译区的靶向作用抑制TRAF7表达,提示miR-126在HUVEC中具有抗细胞凋亡的作用。胡赟〔16〕报道,过表达miR-29c可抑制人血管内皮细胞增殖、迁移和血管形成,其机制与miR-29c靶向胰岛素样生长因子(IDF)-1抑制IDF-1及IDF-1/磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/血管内皮生长因子(VEGF)通路下游的相关基因表达,从而参与调节血管的生成。本研究结果与胡赟〔16〕的研究结果相吻合;进一步研究发现,抑制miR-29c-3p可逆转沙利度胺对HUVECs的增殖抑制和凋亡促进作用;双荧光素酶报告基因检测实验验证,miR-29c-3p靶向负调控TGIF2。

TGIF2为TGIF家族中的关键成员,其参与组织分化、代谢及肿瘤生成〔17,18〕。何淑珍等〔19〕建立高糖诱导的HUVECs细胞,通过MTT、RT-PCR、Western、transwell、流式细胞术研究发现,高糖诱导的HUVECs可抑制TGIF2表达、细胞的增殖和迁移能力,促进凋亡,过表达TGIF2可促进细胞增殖和迁移,抑制凋亡,揭示了TGIF2在血管内皮细胞生长中的调节作用。本研究发现,敲减TGIF2可抑制HUVECs增殖,促进凋亡;进一步深入研究发现,过表达TGIF2可逆转沙利度胺对血管内皮细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。

综上,沙利度胺可抑制血管内皮细胞增殖,促进凋亡,其机制可能与调控miR-29c-3p/TGIF2信号通路有关,为沙利度胺的广泛临床应用奠定基础。

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