小鼠β-防御素2对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响

李琰 李宇飞 丁恒一 刘涛 赵菊梅

(1南阳市医学高等专科学校第一附属医院普通外科，河南 南阳 473000；2延安大学医学院药理学教研室)

结肠癌属于临床常见消化道肿瘤，其发病率、死亡率占据所有恶性肿瘤的第三位，且近年来发病率逐渐升高〔1〕，尽管近年来手术、放化疗治疗取得一定的临床效果，但部分患者5年生存率不高，约为50%，因此探究其病理机制，对于寻找该病的治疗靶点，提高患者的预后十分重要〔2〕。抗菌肽为生物体产生抵抗外界病原的小分子多肽，可抵抗病毒、真菌等，其主要活性成分为防御素。研究显示当肿瘤细胞膜表面特性变化后能够结合防御素，进而发挥抗肿瘤功效〔3〕。体外研究显示小鼠β-防御素(mBD)2重组质粒能够抑制宫颈癌细胞的增殖〔4〕。mBD2是否能够影响结肠癌细胞的增殖，目前尚未有报道。本研究通过体外培养结肠癌细胞，并转染mBD2重组质粒，以期探究其对结肠癌细胞增的影响及可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1细胞与培养 人结肠癌细胞株SW480购于中国科学院上海细胞生物研究所，于-80℃冰箱中保存，使用时置于37℃溶解后，1 000 r/min离心5 min弃去上清，添加含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-链霉素的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2药品与试剂 MTT、DMSO购于美国Sigma公司；RPMI1640培养基、胎牛血清、青霉素与链霉素均购于美国Gibco公司；胰酶溶液购于杭州碧云天生物研究所；Lipofectamine 2000试剂盒购于广州Invitrogen公司；鼠抗人Bcl-2、Bax、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗体购自美国Santa Cruz公司；鼠抗人β-actin抗体购美国CST公司；CCK8试剂盒、聚偏氟乙烯(PDVF)膜购于上海生工生物工程有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗购自美国R&D公司；蛋白提取试剂盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白检测试剂盒购自美国Thermo公司；AnnexinV-FITC/碘化丙啶(PI)细胞凋亡双染试剂盒购自碧云天公司；电子荧光显微镜购自日本Olympus公司；蛋白凝胶成像仪、酶标仪购自Bio-Red公司。

1.3实验方法

1.3.1细胞处理 取对数期培养细胞，调整密度为5×105个/ml，制备单细胞悬浮液。构建重组质粒pcDNA3.1-mBD2，将细胞置于不含胎牛血清的培养液中培养1 h，参照Lipofectamine 2000转染试剂盒进行转染，转染细胞分为3组，将转染试剂、转染空质粒pcDNA3.1、转染重组质粒pcDNA3.1-mBD2分别转染至SW480细胞，命名空白对照组(Control组)、阴性转染组(NC组)、mBD2转染组，转染后置于37℃、5%CO2中培养48 h，随后收集细胞上清，进行后续测定。

1.3.2CKK8法检测细胞增殖情况 收集转染后细胞接种于细胞培养孔中，细胞密度调整为1×105个/ml，每组设置6个重复孔，同时设定空白孔仅添加胞培养液，均放置37℃、5%CO2细胞培养箱内分别培养24 h、48 h、72 h、96 h，培养结束后加入CKK-8试剂，继续培养2 h后，离心后保留下层细胞，每孔添加150 μl DMSO溶液，常温孵育20 min，在酶标仪中570 nm处测定溶液吸光度OD值，计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率(%)=(空白组OD-实验组OD)/空白组OD×100%。

1.3.3细胞形态学观察 细胞分组后继续培养12 h，接种于含有盖玻片6孔板内，过夜后，更换新鲜培养液继续培养24 h，弃去上层细胞培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后加入10%甲醛溶液固定1 h，PBS清洗后，添加500 μl 1 μg/ml Hoechst33342 染液染色10 min，PBS冲洗后置于倒置荧光显微镜下观察细胞形态学变化。

1.3.4平板细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成数目 取对数生长期的各组细胞，0.25%胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，接种含37℃预温培养皿内，放置37℃ 5% CO2细胞培养箱中培养10 d，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃去上清液，PBS清洗后添加4%多聚甲醛固定细胞，室温下放置15 min，采用含0.1% Gimsa溶液染色30 min后，然后用流水缓慢洗去染色液，常温下干燥，拍照后用肉眼直接计数细胞克隆形成数目。

1.3.5流式细胞术 将转染后培养48 h的细胞中加入胰蛋白酶进行消化，调整细胞密度为1×106个/ml，用预冷PBS清洗2次后，加入70%乙醇溶液固定过夜，PBS清洗细胞后加入FITC-AV，避光下孵育20 min，与细胞流式仪中检测细胞凋亡情况。收集转染后培养48 h的细胞，添加200 μl PBS于75%乙醇冰上固定30 min。将细胞用0.05 mg/ml PI和0.5 mg/ml的RNA酶A孵育30 min后，置于流式细胞仪下检测各时期DNA含量变化情况。

1.3.6Western印迹法检测Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达情况 转染后48 h，采用蛋白提取试剂盒各组SW480细胞总蛋白。采用BCA蛋白试剂盒对细胞中总蛋白含量进行测定。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离等量蛋白质，转移至PDVF膜上，置于4℃下添加一抗与β-actin(1∶500)孵育过夜。洗涤后添加辣根过氧化物酶缀合的二抗(1∶5 000)常温下孵育2 h。采用Tanon600图像分析系统对Bcl-2、Bax、活化型caspase-3蛋白水平进行定量分析。

1.4统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析及SNK-q检验。

2 结 果

2.1稳定转染细胞株鉴定 转染48 h后，流式细胞仪检测转染效率，结果显示，转染后结肠癌细胞株SW480发出绿色荧光，其转染效率为85.39%以上，见图1。

2.2CKK8法检测细胞增殖情况 随着细胞培养时间延长，mBD2转染组细胞增殖抑制率逐渐升高，在同一时间点，与Control、NC组相比，mBD2转染组细胞抑制率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3细胞形态学观察 Hoechst染色显示，Control、NC组细胞形态、大小均正常，mBD2转染组细胞荧光强度增高，部分细胞出现碎片化。见图2。

2.4细胞克隆形成情况 与Control组〔(72.44±13.58)个〕、NC组〔(76.53±12.16)个〕相比，mBD2转染组〔(34.27±4.78)个〕细胞克隆形成数目均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图1 荧光显微镜检测转染情况(×200)

组别24 h48 h72 h96 hControl组6.36±0.876.49±0.796.93±0.887.01±0.71NC组6.57±0.926.66±0.896.75±1.026.89±0.84mBD2转染组17.74±2.651)26.34±3.161)34.62±4.261)41.18±5.391)

与Control组、NC组比较：1)P<0.05，下表同

图2 结肠癌细胞Hoechst染色(×100)

图3 细胞克隆形成情况

2.5流式细胞术检测细胞凋亡情况 与Control组〔(5.46±1.07)%〕、NC组〔(4.95±1.03)%〕相比，mBD2转染组细胞凋亡率〔(81.63±13.26)%〕升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.6细胞周期检测 与Control、NC组相比，mBD2转染组G1期DNA量均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。3组G2期、S期DNA量无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组细胞周期变化

2.7细胞中Bax、Bcl-2、活化型caspase3蛋白表达情况 与Control、NC组相比，mBD2转染组细胞中Bax、活化型caspase3蛋白表达均升高，Bcl-2蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4，表3。

图4 各组细胞中Bax、Bcl-2、活化型caspase3蛋白的表达

组别Bax/β-actinBcl-2/β-actin活化型caspase3/β-actinControl组0.23±0.030.93±0.170.36±0.04NC组0.25±0.040.88±0.040.39±0.05mBD2转染组0.88±0.151)0.16±0.021)0.92±0.101)

3 讨 论

结肠癌严重威胁人类健康，死亡率、发病率居高不下，因此寻找安全、高效的治疗方法是目前的重要任务。临床传统治疗主要以手术辅助放化疗为主，但放化疗副作用较大，患者难以忍受。近年来随着分子生物学的发展，结肠癌基因治疗获得良好的进展，但安全问题及长期疗效仍有待解决。肿瘤疫苗近期在结肠癌治疗中取得了突破性进展，通过激活自身免疫系统增强机体抗癌能力，进而抑制肿瘤的增殖，降低肿瘤转移、复发率〔5〕。防御素是产生免疫反应时自身细胞分泌的，具有抵抗细胞毒性、微生物的小分子多肽，在受到外界刺激时可即刻产生抗微生物反应，保护机体以免受到外界病原微生物损害，在固有免疫中发挥重要的调控作用，目前广泛用于抗病毒、抗菌研究。近期研究显示防御素可通过裂解肿瘤细胞，进而抑制肿瘤的增殖，提示防御素可能为肿瘤免疫治疗的靶点〔6〕。

在BD防御家族中，mBD1为主要表达，其在肾脏、呼吸道黏膜上皮细胞中均表达。而mBD2、mBD3、mBD4在外界LPS及炎症因子如IL-1、IL-17等诱导下激活NF-kB通路而表达。mBD2主要于呼吸道黏膜上皮中表达〔7〕。Zhang等〔8〕研究显示mBD2可使小鼠对肿瘤抗原产生免疫应答反应进而抑制肿瘤的生长。在荷瘤模型小鼠中研究显示mBD2能够明显抑制荷瘤小鼠腹水积累〔9〕。另外在宫颈癌中研究显示其能够抑制宫颈癌肿瘤的生长，抑制率可达40%〔10〕。Ping等〔11〕通过构建mBD2重组质粒并转染至CT26肿瘤细胞，结果显示BD2具有趋化DC的活性，肿瘤细胞生长受到抑制。本研究细胞转染后稳定性较强，随着培养时间的延长，细胞增殖抑制率逐渐升高，表明mBD2对结肠癌细胞SW480具有一定的抑制作用。以往研究显示mBD2可能通过影响肿瘤细胞呼吸，引发细胞代谢紊乱，进而降低其活性〔12〕，但具体机制还有待深入研究。

肿瘤的发生属于周期性疾病，肿瘤细胞周期失控是导致细胞过度繁殖或肿瘤细胞生长抑制的主要原因。细胞周期主要由G1、S、G2期及分裂期M组成，其中G1期决定了细胞总周期的长短。越来越多证据表明，通过调控细胞周期有关蛋白进而对细胞周期进行调控，进而影响细胞体外增殖活性〔13〕。李海星等〔14〕研究显示对人结肠癌细胞经吴茱萸碱处理后能够使细胞周期阻滞在G1期，进而抑制结肠癌细胞的增殖，表明通过调控结肠癌的细胞周期，能够明确药物对结肠癌增殖影响的机制，可为结肠癌的临床治疗提供一定的参考。本研究表明mBD2能够使细胞周期阻滞在G1期，引起细胞周期阻滞，从而参与调控结肠癌细胞的周期进展，发挥抑制肿瘤细胞增殖作用。

细胞凋亡时涉及一系列基因激活、表达，其中凋亡诱导因子和凋亡抑制因子占有重要作用〔15〕。caspase-3通路是机体正常发育过程中与细胞凋亡密切相关的决定性因素，能够剪切凋亡过程较多关键蛋白进而在细胞增殖、分化、细胞凋亡过程中发挥着重要的调控作用〔16〕。另外Bcl-2家族也与细胞凋亡密切相关，正常情况下，Bax与Bcl-2和Bcl-xl形成二聚体阻止细胞凋亡；受到诱导凋亡刺激时，Bax蛋白表达增加，从细胞质中迁移至线粒体和核膜上，促使Bax-Bax二聚体在线粒体膜上形成，使线粒体膜通透性增加，使得凋亡诱导因子(AIF)、细胞色素C等凋亡因子进入细胞质中，激活caspase-3通路而诱发细胞凋亡〔17〕。在前列腺癌中研究显示防御素能够诱导凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9表达升高，诱导癌细胞凋亡，进而发挥抗肿瘤作用，表明防御素能够诱导癌细胞凋亡，进而抑制肿瘤的增殖〔18〕。本研究结果表明mBD2可能通过调控Bcl-2/Bax表达，促进活化型caspase-3凋亡通路激活而实现对结肠癌细胞SW480凋亡的诱导作用，提示推测mBD2可能作为治疗结肠癌的生物靶标。