Fascin-1在甲状腺癌细胞中表达及其对细胞生物学行为的调控作用

王聚 蒋茂燕 杨培庆

(遵义医科大学附属医院核医学科，贵州 遵义 563003)

甲状腺癌起源于甲状腺滤泡旁细胞或甲状腺滤泡细胞，甲状腺癌具有恶性程度高、转移快等特点，研究甲状腺癌细胞生长、侵袭等生物学分子机制对甲状腺癌的治疗具有重要意义〔1，2〕。聚束蛋白(Fascin)-1是肌动蛋白结合蛋白，其具有促进肌动蛋白成束的作用，参与细胞骨架的调控过程，Fascin-1在内皮细胞、间质细胞、树突细胞、神经细胞中广泛表达，在其他正常细胞中几乎不表达〔3～5〕。研究显示，Fascin-1在肿瘤组织中高表达，目前在食管癌、结肠癌、肺癌等肿瘤中已经得以证实，肿瘤细胞敲低Fascin-1后，细胞凋亡增多，肿瘤细胞转移能力下调〔6～8〕。Fascin-1在甲状腺癌组织中表达上调，而对于其在甲状腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学特性中的作用尚不明确〔9〕。本实验探讨敲低Fascin-1在甲状腺癌细胞生物学特性中的作用，为研究Fascin-1在甲状腺癌发生中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料 基质金属蛋白酶(MMP)-2、-9抗体、活化的Caspase(C-Caspase)-9抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；Trizol细胞总RNA抽提试剂购自上海史瑞克生物科技有限公司；SYBR实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购自上海吉凯基因化学技术有限公司；引物由上海生工生物合成；C-Caspase-3抗体、Fascin-1抗体购自美国Bioss；Fascin-1 shRNA重组慢病毒和阴性对照慢病毒购自山东维真生物科技有限公司；人甲状腺癌细胞K1、GTHW3、FTC-133和人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1购自美国ATCC。

1.2实时PCR检测Fascin-1表达 收集人甲状腺癌细胞K1、GTHW3、FTC-133和人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1，提取细胞中的总RNA，RNA溶解在无核糖核酸酶的超净水中，以紫外分光光度计检测A260和A280，A260和A280比值在1.8～2.0。按照逆转录试剂盒合成cDNA，以SYBR荧光染料法进行qRT-PCR。反应结束后获取各个反应的Ct值，根据2-△△Ct法对Fascin-1表达量进行分析，GAPDH作为参照。Fascin-1正义：5′-CTCCCTGCTAACCCCTTCTCC-3′，反义：5′-CCCAACCGTCCCTTAGCC-3′。GAPDH正义：5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，反义：5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。

1.3Western印迹检测Fascin-1表达 收集人甲状腺癌细胞K1、GTHW3、FTC-133和人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1，添加放射免疫沉淀(RIPA)裂解液，迅速混合以后，放在冰上静置20 min，把各组细胞收集以后，4℃离心20 min，吸取上清，经二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度以后，在蛋白样品中添加5×上样缓冲液混合液，100℃煮沸5 min，放在冰箱内备用。吸取50 μg的蛋白样品，添加到上样孔内，电泳开始的电压设置为80 V，溴酚蓝要进入分离胶时调整电压为100 V，电泳时间约3 h，此时溴酚蓝跑出凝胶。在4℃，100 V恒压条件下进行转膜，将凝胶上的蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。把PVDF膜放在5%牛血清白蛋白中孵育2 h后，置于一抗杂交袋内，一抗以1∶400稀释，4℃过夜，再置于二抗杂交袋内，二抗以1∶2 000稀释，在室温孵育2 h。电化学发光(ECL)显色，显影后，对蛋白条带进行半定量分析，内参为GAPDH。

1.4细胞分组和感染 K1细胞接种到6孔板内，细胞接种密度为104个细胞/孔，细胞生长密度为30%～40%时，在细胞中添加慢病毒，感染复数(MOI)=20，培养24 h后换液，继续培养72 h，观察绿色荧光蛋白(GFP)表达，转染效率高于85%用于后续实验。把感染Fascin-1 shRNA和阴性对照慢病毒的K1细胞记为Fascin-1 shRNA和shRNA-NC，把未做感染的细胞作为对照(Control)。用实时定量PCR和Western印迹检测Fascin-1 shRNA干扰效果，步骤同1.2和1.3。

1.5MTT检测细胞增殖 Control、shRNA-NC、Fascin-1 shRNA细胞接种到96孔板内，每孔加3×103个细胞，继续培养24 h以后，在每孔中添加20 μl的噻唑蓝(MTT)溶液，继续培养4 h，把孔内的液体弃掉，添加150 μl的二甲基亚砜(DMSO)，溶解10 min后，检测490 nm的A值，经空白孔调零以后，分析细胞存活率变化。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡 取Control、shRNA-NC、Fascin-1 shRNA细胞，在细胞中添加结合缓冲液约500 μl，添加5 μl的Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)，混匀后，再添加5 μl的碘化丙啶(PI)，置于室温中避光反应5 min，在1 h内进行流式细胞仪检测。

1.7Transwell小室检测细胞侵袭 取Control、shRNA-NC、Fascin-1 shRNA细胞，用24孔8 μm滤膜微孔Transwell小室进行细胞侵袭实验，在小室内添加基质胶将小室湿化以后，在小室的上室每孔加入5×108个细胞(以不含血清的培养液稀释)，下室内加入1 000 μl的细胞培养液，常规方法培养24 h后，把小室表面的细胞擦掉，用结晶紫染色以后，显微镜下观察细胞侵袭数目(×100)。

1.8划痕愈合实验检测细胞迁移 取Control、shRNA-NC、Fascin-1 shRNA细胞，接种到24孔板内，接种密度为每孔添加5×104个细胞，细胞汇合成片以后，在24孔板内划线，添加1%胎牛血清的杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)继续培养24 h。显微镜下观察0 h和24 h划痕的宽度(×40)，计算细胞迁移距离(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)。

1.9Western印迹检测细胞中MMP-2、-9、C-Caspase-3、-9蛋白水平 取Control、shRNA-NC、Fascin-1 shRNA细胞，步骤同1.3，其中MMP-2、-9抗体以1∶400稀释，C-Caspase-3、-9抗体以1∶600稀释。

1.10统计分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析和SNK-q检验。

2 结 果

2.1Fascin-1蛋白和mRNA在甲状腺癌细胞中高表达 人甲状腺癌细胞K1、GTHW3、FTC-133中Fascin-1蛋白和mRNA表达水平显著高于人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1(P<0.05)。K1细胞中Fascin-1蛋白和mRNA表达水平显著高于GTHW3、FTC-133细胞(P<0.05)。见图1和表1。选用表达水平较高的K1细胞做后续实验。

2.2Fascin-1 shRNA对甲状腺癌细胞中Fascin-1 mRNA和蛋白表达影响 Fascin-1 shRNA重组慢病毒感染后的甲状腺癌细胞中Fascin-1 mRNA和蛋白表达水平较其他两组显著降低(P<0.05)。Fascin-1 shRNA能够成功下调甲状腺癌细胞中Fascin-1 mRNA和蛋白的表达。见图2和表2。

图1 人甲状腺癌细胞K1、GTHW3、FTC-133和人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1中Fascin-1蛋白水平

细胞Fascin-1 mRNAFascin-1蛋白K14.15±0.361)0.32±0.041)GTHW33.01±0.231)2)0.16±0.021)2)FTC-1333.56±0.141)2)0.22±0.021)2)Nthy-ori 3-11.00±0.000.03±0.01F/P值111.165/0.00070.520/0.000

与Nthy-ori 3-1比较：1)P<0.05；与K1比较：2)P<0.05

图2 Western印迹测定Fascin-1 shRNA对甲状腺癌细胞中Fascin-1蛋白表达影响

表2 慢病毒感染后甲状腺癌细胞中Fascin-1 mRNA和蛋白表达水平

与shRNA-NC、Control比较：1)P<0.05;下表同

2.3敲低Fascin-1抑制甲状腺癌细胞增殖并诱导凋亡 敲低Fascin-1后的甲状腺癌细胞的存活率显著较其他两组降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，敲低Fascin-1抑制甲状腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。见图3，表3。

2.4敲低Fascin-1降低甲状腺癌细胞侵袭和迁移能力 敲低Fascin-1后甲状腺癌细胞侵袭数目和迁移距离均较其他两组显著降低(P<0.05)，敲低Fascin-1抑制甲状腺癌细胞侵袭和迁移能力。见表4。

图3 流式细胞术测定敲低Fascin-1对甲状腺癌细胞凋亡的影响

表3 敲低Fascin-1后甲状腺癌细胞存活率和凋亡率比较

表4 敲低Fascin-1后甲状腺癌细胞侵袭数目和迁移距离比较

2.5敲低Fascin-1对甲状腺癌细胞中MMP-2、-9蛋白、C-Caspase-3、-9蛋白表达影响 敲低Fascin-1后的甲状腺癌细胞中MMP-2、-9蛋白水平较其他两组显著降低，C-Caspase-3、-9蛋白水平较其他两组显著升高，敲低Fascin-1抑制甲状腺癌细胞中MMP-2、-9蛋白表达，提高细胞中C-Caspase-3、-9蛋白水平。见表5和图4。

表5 敲低Fascin-1后甲状腺癌细胞中MMP-2、-9、C-Caspase-3、-9蛋白水平比较

图4 Western印迹检测敲低Fascin-1后甲状腺癌细胞中MMP-2、-9、C-Caspase-3、-9蛋白水平

3 讨 论

Fascin是从海胆卵母细胞中分离出来的一种结合蛋白，其可以与肌动蛋白紧密连接形成束状结构，在人类中已经发现Fascin的3种形式，其中Fascin-1在神经系统组织和间质组织中表达，Fascin-2在视网膜细胞中广泛表达，Fascin-3特异性表达于睾丸组织中，Fascin-1与肿瘤发生有关〔10～12〕。Fascin-1与肌动蛋白结合形成束状结构，并且Fascin-1定位于束状结构的核心部位，其可以促进细胞形成伪足样结构，促进细胞运动和迁移〔13〕。目前在卵巢癌、结肠癌等肿瘤组织中已经发现Fascin-1高表达，敲低其表达不仅可以下调肿瘤细胞的转移能力，还可以诱导肿瘤细胞凋亡〔14，15〕。本实验结果表明，Fascin-1在甲状腺癌细胞中表达水平高于正常甲状腺细胞，并且敲低其表达后的甲状腺癌细胞增殖、侵袭、迁移能力均降低，细胞凋亡增多，Fascin-1在甲状腺癌细胞中高表达，敲低Fascin-1表达具有抗甲状腺癌作用。

肿瘤细胞的凋亡与肿瘤细胞中Caspase凋亡反应有关，Caspase是一种广泛存在于人类各种组织和器官中的天冬氨酸蛋白水解酶，其在内皮细胞、上皮细胞、神经细胞等细胞凋亡中均具有调控作用，细胞在受到凋亡信号刺激以后，细胞内Caspase蛋白家族成员能够迅速激活，诱导细胞凋亡〔16，17〕。Caspase-9和Caspase-3分别是Caspase凋亡反应的起始和执行因子，正常情况下以没有活性的酶原形式存在，只有被激活后才可以诱导细胞凋亡〔18，19〕。敲低Fascin-1具有激活细胞内Caspase级联反应的作用〔20〕。本实验表明，敲低Fascin-1具有激活Caspase级联反应诱导甲状腺癌细胞凋亡的作用。

肿瘤细胞的侵袭和迁移过程是一个多步骤过程，细胞外基质降解是细胞转移的关键步骤之一，肿瘤细胞分泌的MMPs是细胞降解外基质的主要蛋白酶，MMP-2和MMP-9是MMPs家族中与肿瘤关系最密切的成员，二者几乎可以降解细胞外基质的所有成分，在肿瘤转移中发挥促进作用〔21～23〕。在胰腺癌、胆管癌等肿瘤细胞中的研究表明，敲低Fascin-1具有下调肿瘤细胞中MMPs表达水平的作用〔24，25〕。本研究提示敲低Fascin-1通过抑制甲状腺癌细胞合成MMP-2、-9降低细胞的侵袭和迁移能力。

综上，Fascin-1在甲状腺癌细胞中高表达，敲低Fascin-1具有抑制甲状腺癌细胞增殖、侵袭、迁移并诱导甲状腺癌细胞凋亡的作用，Fascin-1在甲状腺癌发生中可能发挥促进作用，靶向Fascin-1可能是治疗甲状腺癌的途径之一。