瑞舒伐他汀对CVB3诱导小鼠病毒性心肌炎的保护作用①

朱 雯 赵 锦

(山东省淄博市第一医院心血管内科，淄博 255200)

心肌炎是指感染、物理、化学因素或自身免疫病引起的心肌炎症性病变，病毒性感染是最常见病因[1]。症状包括心率不齐、运动能力下降、呼吸急促和胸部疼痛，由于扩张性心肌病和心脏骤停引起心力衰竭[2]。现已发现20多种病毒可引起心肌炎，其中以柯萨奇病毒最为常见[3]。心肌炎的诊断方法包括心电图、肌钙蛋白、核磁成像和心脏超声。目前心肌炎缺少特异的治疗措施，以辅助治疗和限制体力活动为主，常用的药物有血管紧张素转换酶抑制剂、β受体阻滞药和利尿剂[4,5]。据统计，2013年全年约有150万人诊断为急性心肌炎，其中男性患者数量居多[6]。瑞舒伐他汀是临床上常用的调节血脂的药物，能选择性地抑制肝脏中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaric coenzyme A，HMG-COA)还原酶，使低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯显著降低，且降脂效果优于同类药物[7]。研究发现，瑞舒伐他汀具有改善血管内皮稳定、抗氧化、抗炎性反应和免疫调节的作用[8,9]。近来有报道显示，瑞舒伐他汀具有心肌保护作用，抑制自身免疫引起的心肌炎症[10]，但瑞舒伐他汀对病毒性心肌炎的影响尚未见报道。本文以病毒性心肌炎小鼠为模型，研究瑞舒伐他汀对病毒性心肌炎的保护作用及相关的机制。

1 材料与方法

1.1材料 BALB/c雄性小鼠，4～6周龄，体重16～18 g，购自广东医学实验动物中心。瑞舒伐他汀为阿斯利康制药有限公司产品。HE染色试剂盒、TUNEL染色试剂盒购自碧云天生物；肌红蛋白(Myoglobin,Mb)、肌酸激酶同工酶(Creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)和肌钙蛋白1(Cardiac troponin 1,cTn1)和白细胞介素(Interleukin 6,IL-6)酶联免疫吸附(ELISA)测定试剂盒均购自上海邦奕生物科技有限公司；小鼠TNF-α ELISA测定试剂盒购自艾美捷科技有限公司。柯萨奇B3病毒(Coxsackie virus B3，CVB3)来源于中国科学院昆明病毒所。

1.2方法

1.2.1CVB3病毒扩增和滴度检测 取对数生长期的Hela细胞，接种于6孔板，待覆盖面积达80%以上时，加CVB3病毒原液，继续培养2 d。2 000 r/min离心10 min，收集上清液。采用Reed-Muench法做滴度测定，细胞接种于96孔板，病毒悬液用梯度稀释法稀释成10-10～10-1噬菌斑形成单位(Plaque forming unit，PFU)后，加病毒悬液至相应细胞孔，设置空白组和对照组，培养72 h后，检测细胞病变，以50%的病变细胞为判断标准，计算半数组织培养感染量(50% tissue culture infective dose,TCID50)。

1.2.2小鼠分组及模型的建立 将32只BALB/c小鼠随机分成4组：对照组、瑞舒伐他汀组、CVB3诱导组和CVB3+瑞舒伐他汀组，每组8只。CVB3诱导组和CVB3+瑞舒伐他汀组小鼠腹腔注射 0.5 ml TCID50的CVB3病毒液。瑞舒伐他汀组和CVB3+瑞舒伐他汀组小鼠腹腔注射5 mg/kg BW 的瑞舒伐他汀，每天1次，连续注射12 d。

1.2.3HE染色 小鼠处死前，真空采血管取血。剪开右心耳，生理盐水冲洗，多聚甲醛灌注100 ml。乙醇逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片常规脱蜡至水，苏木素染色10 min，自来水洗，盐酸乙醇分色，水洗返蓝，70%乙醇处理5 min，80%乙醇处理5 min，伊红液染色20 s，95%乙醇5 min，无水乙醇5 min，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.4TUNEL染色 石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗5 min，加蛋白酶K室温下水解20 min；蒸馏水洗，3%过氧化氢室温下反应5 min，PBS洗2次；加TdT缓冲液，室温5 min，吸干后加TdT反应液，湿盒中37℃反应1 h；加反应终止液，37℃反应30 min；PBS洗3次，加过氧化物酶标记的抗体，湿盒中室温孵育30 min；PBS洗3次，加显色液，室温反应5 min。蒸馏水洗，脱水，透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察并拍照，用Image-pro plus软件分析阳性细胞数目。

1.2.5心脏功能指标检测 小鼠感染CVB3病毒第12天后，进行心脏功能检测，术前禁食不禁水4 h。小鼠腹腔注射3%的戊巴比妥钠溶液麻醉，仰卧位固定。备皮，沿颈部剪开皮肤，分离气管，插入连接呼吸机的导管。分离右颈总动脉，将微导管经右颈总动脉插入升主动脉及左心室。多道生理放大器和记录仪测量左心室收缩压峰值，动脉导管记录平均动脉压和心率。

1.2.6ELISA测定 将采取的血液样品于室温静置2 h，使血清析出，4℃离心机中2 500 r/min离心10 min后，取上清，生理盐水稀释后备用。取100 μl样品至反应孔，设置标准样品孔和空白孔，加检测抗体，37℃孵育90 min，洗涤液洗5次，加生物素标记的辣根过氧化物酶，37℃温育30 min，洗涤液洗5次；加显色液，37℃避光反应15 min，加终止液，检测波长为450 nm处吸收值。每个标本测3个复孔，测定值为3个复孔的平均值。

1.3统计学分析 采用SPSS18.0统计软件进行实验数据分析，两组间比较使用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1瑞舒伐他汀缓解CVB3诱导的小鼠心肌组织损伤 对照组和瑞舒伐他汀组心肌细胞结构正常，排列规则，横纹整齐，未见炎症细胞浸润(图1)；CVB3诱导组心外膜充血，心肌组织出现炎症细胞浸润，细胞间隙变大，出现空泡(图1)。CVB3+瑞舒伐他汀组，心肌组织病理损伤明显减轻(图1)。表明瑞舒伐他汀可以缓解CVB3诱导的小鼠心肌组织损伤。

2.2瑞舒伐他汀抑制CVB3诱导的小鼠心肌细胞凋亡 TUNEL染色结果显示，对照组和瑞舒伐他汀组相比，凋亡阳性心肌细胞的比率没有明显变化(P>0.05，图2)。CVB3诱导组与对照组相比，凋亡细胞的比率显著上升，提示CVB3诱导小鼠心肌细胞发生凋亡(P<0.05，图2)。CVB3+瑞舒伐他汀组与CVB3诱导组相比，凋亡细胞比率显著下降(P<0.05，图2)。实验结果表明，瑞舒伐他汀抑制CVB3诱导的小鼠心肌细胞凋亡。

2.3瑞舒伐他汀对心肌炎小鼠心脏功能的影响 瑞舒伐他汀组与对照组相比，平均动脉压(Mean arterial pressure，MAP)、心率(Heart rat，HR)、左心室收缩压(Left ventricular systolic pressure,LVSP)均没有显著变化(P>0.05，图3)。CVB3诱导组与对照组相比，MAP、HR和LVSP显著降低(P<0.05，图3)。CVB3诱导的心肌炎小鼠经瑞舒伐他汀加药后，MAP、HR和LVSP显著升高(P<0.05，图3)。实验结果表明，瑞舒伐他汀改善CVB3诱导心肌炎小鼠的心脏功能。

2.4瑞舒伐他汀对心肌炎小鼠心肌酶的影响 瑞舒伐他汀组与对照组相比，Mb、CK-MB和cTn1的含量差异没有显著统计学意义(P>0.05，图4)。CVB3诱导组与对照组相比，Mb、CK-MB和cTn1的含量显著上升(P<0.05，图4)；CVB3+瑞舒伐他汀组与CVB3组相比，Mb、CK-MB和cTn1的含量显著降低(P<0.05，图4)。结果表明，瑞舒伐他汀缓解CVB3诱导的小鼠心肌坏死。

图1 HE染色观察心肌组织病理损伤(×400)Fig.1 HE staining was used to observe pathological injury of cardiac tissue(×400)

图2 TUNEL染色检测细胞凋亡情况(×400)

Fig.2 TUNEL staining was used to detect apoptosis conditio

Note: Compared with the Ctrl group，*.P<0.05；compared with the CVB3 group，#.P<0.05.

2.5瑞舒伐他汀抑制CVB3诱导的小鼠心肌炎性反应 ELISA检测心肌组织中炎症因子的含量，瑞舒伐他汀组与对照组相比，TNF-α和IL-6的含量差异没有显著统计学意义(P>0.05，图5)。CVB3组与对照组相比，TNF-α和IL-6的含量显著上升，提示CVB3诱导小鼠发生炎性反应(P<0.05，图5)。CVB3+瑞舒伐他汀组与CVB3组相比，TNF-α和IL-6的含量显著降低(P<0.05，图5)，表明瑞舒伐他汀抑制CVB3诱导的小鼠心肌炎性反应。

图3 心脏功能指标的检测Fig.3 Detection of cardiac function indicatorsNote: Compared with the Ctrl group，*.P<0.05；compared with the CVB3 group,#.P<0.05.

图4 血液中心肌酶的检测Fig.4 Detection levels of myocardial enzymesNote: Compared with the Ctrl group,*.P<0.05；compared with the CVB3 group,#.P<0.05.

图5 ELISA检测炎症因子的含量Fig.5 Concentration of inflammatory factors were detec-ted by ELISANote: Compared with the Ctrl group,*.P<0.05；compared with the CVB3 group,#.P<0.05.

3 讨论

病毒性心肌炎是常见的心血管疾病，是引起儿童和年轻成年人猝死的重要原因。目前病毒性心肌炎的确切机制并不清楚，心肌炎缺少特异的治疗药物，治疗方案以减少心肌负担、改善心肌营养和消除炎症为主。柯萨奇病毒是无包膜的单链RNA病毒，在消化系统中复制，由呼吸系统和粪便传播[11]。柯萨奇病毒产生溶细胞毒素使心肌受损，以CVB3的致病性最强[12]。本文以CVB3感染BALB/c小鼠建立病毒性心肌炎模型，探索瑞舒伐他汀对病毒性心肌炎的保护作用。

病毒性心肌炎常造成局限性和弥散性的心肌组织坏死、炎症细胞浸润。CVB3组与对照组相比，心肌组织出现明显的病理变化，表明病毒性心肌炎模型建模成功。由于瑞舒伐他汀具有降脂和心血管功能调节能力，在许多疾病中均表现出器官保护作用，如为易中风的大鼠提供终末器官保护作用，对慢性肾病患者具有保护作用[13]。瑞舒伐他汀治疗病毒性心肌炎小鼠后，小鼠心肌组织病理损伤明显减轻，炎症细胞浸润明显减少。实验结果表明，瑞舒伐他汀能缓解CVB3病毒引起的BALB/c小鼠心肌组织病理损伤。

细胞凋亡在机体生长、发育等各个阶段均发挥着重要的作用。病毒感染后，导致心肌细胞结构和功能的破坏，同时激活Fas通路、Bcl-2家族和Caspase家族，启动心肌细胞凋亡[14]。病毒感染造成心肌细胞死亡是导致心肌炎患者心脏功能减退的主要原因。大量报道证实，瑞舒伐他汀能抑制细胞自噬，如Nam等[15]发现瑞舒伐他汀能缓解环孢霉素诱导肾病大鼠模型的炎症和凋亡。鲍晓梅等[16]实验也证实，瑞舒伐他汀抑制高半胱氨酸诱导的内皮祖细胞凋亡。本研究结果显示，瑞舒伐他汀加药后的病毒性心肌炎小鼠心肌组织细胞凋亡数目明显减少，表明瑞舒伐他汀抑制CVB3诱导的小鼠心肌细胞凋亡。

心肌肌钙蛋白是调节肌肉收缩的亚单位，以复合物或游离状态存在于心肌细胞中，正常情况下不会在血液中出现。当心肌受损时，心肌肌钙蛋白被释放到血液循环中，因此将心肌肌钙蛋白作为心肌损伤的特异性标志物[17]。CK-MB是心肌受损的早期指标[18]。肌红蛋白具有贮存和运输氧的功能，心肌损伤时，血液中的肌红蛋白迅速升高[19]。余波等[20]发现，急性心肌梗死患者服用瑞舒伐他汀后，血清中cTn1和CK-MB的含量显著降低。本研究ELISA测定结果显示，加药处理后的心肌炎小鼠，血液中心肌酶的含量均不同程度地降低。结果表明，瑞舒伐他汀缓解CVB3对小鼠心肌组织的损伤。

TNF-α是巨噬细胞分泌的具有多种生物学效应的细胞因子，能激活炎症细胞参与炎性反应，介导免疫应答。研究发现，病毒性心肌炎患者血清中和心肌中TNF-α的水平升高，提示TNF-α与病毒性心肌炎相关[21]。IL-6是机体应对感染和组织损伤产生的重要介质，参与免疫调节和炎性反应[22]。大量研究证实，瑞舒伐他汀具有抗炎性反应的作用，如Gianella等[23]研究发现，瑞舒伐他汀预防中风大鼠的肾脏炎性反应和纤维化。Kim等[24]实验也证实，瑞舒伐他汀能降低内皮细胞中IL-6的表达，抑制炎性反应。本文ELISA实验结果显示，瑞舒伐他汀加药后，心肌炎小鼠的心肌组织中IL-6和TNF-α的含量显著降低。实验结果与前人研究一致，表明瑞舒伐他汀抑制心肌炎小鼠的炎性反应。

综上所述，本文以柯萨奇病毒感染BALB/c小鼠，建立心肌炎小鼠模型，模型小鼠经瑞舒伐他汀加药后，心肌组织的病理损伤减轻，炎性反应和细胞凋亡得到有效的抑制；心脏功能有效缓解。瑞舒伐他汀抑制炎性反应和细胞凋亡的分子机制还有待研究。