基于G1-熵权法和响应面设计优化益气活血方醇提工艺

2019-09-02易丽娟邹苏兰柳兰李雅郭紫妍

中国中医药信息杂志 2019年7期

易丽娟邹苏兰柳兰李雅郭紫妍

摘要：目的优化益气活血方醇提工艺参数。方法采用G1-熵权法和响应面设计，在单因素试验基础上，以乙醇体积分数、乙醇用量、提取时间为考察因素，黄芪甲苷和丹参酮类成分的转移率及浸膏得率为评价指标，优选益气活血方醇提最佳工艺参数。结果最佳醇提工艺参数为：用70%乙醇提取2次，第1次用8倍量乙醇提取120 min，第2次用6倍量乙醇提取90 min。3次平行验证试验平均综合评分为95.79，RSD=0.74%。结论优选出的益气活血方醇提最佳工艺稳定可行，可为益气活血方的新药开发提供依据。

关键词：益气活血方;醇提工艺;G1-熵权法;响应面设计;黄芪甲苷;丹参酮类成分

中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）07-0073-06

Abstract： Objective To optimize the technological parameters of ethanol extraction of Yiqi Huoxue Prescription. Methods Using G1-entropy method and response surface design， based on the single factor experiment， the volume fraction of ethanol， the amount of ethanol and the extraction time were taken as the evaluation factors. Extract yield and the transfer rate of astragaloside Ⅳ and tanshinones were evaluation indexes. The technological parameters of ethanol extraction of Yiqi Huoxue Prescription was optimized. Results The optimal technological parameters of ethanol extraction were extracted twice with 70% ethanol; the first ethanol dosage was 8 times， the extraction time was 120 min; the second ethanol dosage was 6 times， and the extraction time was 90 min. The average score of the three parallel validation tests was 95.79 and the RSD was 0.74%. Conclusion The optimal process of ethanol extraction of Yiqi Huoxue Prescription is stable and feasible， which can provide references for development of new medicine of Yiqi Huoxue Prescription.

Keywords： Yiqi Huoxue Prescription; ethanol extraction process; G1-entropy method; response surface design; astragaloside Ⅳ; tanshinones

益氣活血方是湖南中医药大学郭志华教授依据中医理论结合多年临床经验，运用益气活血、利水消肿中药组方而成，用于治疗心气亏虚、血瘀水停型心衰患者[1-2]。方中以黄芪为君药，丹参和红花均为臣药，佐以人参、泽泻及猪苓等。研究表明，黄芪抗心衰的主要活性成分为黄芪甲苷，其对心肌细胞损伤有抗凋亡作用[3-5]。丹参中的脂溶性丹参酮类具有抗动脉粥样硬化、保护心脏等作用[6-7]。这两类主要药效成分醇提得率普遍高于水提，故采取醇提方式对益气活血方中脂溶性药效成分进行提取工艺研究。为避免单一指标考察的片面性，本研究选取方中主要药效成分及浸膏得率为综合考察指标，并采用基于G1法和熵权法的组合赋权法[8]与响应面设计[9]优选合理、可行的益气活血方醇提工艺条件参数，为益气活血方的后期研究及新药开发提供依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪（配置DAD检测器），安捷伦公司;Allteeh E1803300蒸发光检测器，天津埃文森科技有限公司;DK-98-11A电热恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司;CP114电子天平，奥豪斯仪器有限公司。

药物饮片购于湖南省昌都振兴中药饮片实业有限公司，经湖南中医药大学龚力民副教授鉴定，均符合2015年版《中华人民共和国药典》（一部）规定。黄芪甲苷对照品（批号110781-201717，质量分数96.9%）、丹参酮ⅡA对照品（批号110766-201721，质量分数99.5%），中国食品药品检定研究院;水为超纯水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 益气活血方醇提液的制备

称取益气活血方醇提药物饮片120.0 g（黄芪45.0 g、丹参22.5 g等），分别以不同醇提工艺条件进行加热回流提取，过滤，滤液备用，即得。

2.2 黄芪甲苷转移率测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱为Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流动相为乙腈-水（36∶64），流速0.8 mL/min，柱温25 ℃。ELSD参数：漂移温度60 ℃，载气流速1.5 L/min，增益4。理论塔板数按黄芪甲苷峰计算均不低于4000。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取黄芪甲苷对照品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得0.5 mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液。

2.2.3 黄芪供试品溶液的制备

精密称取黄芪中粉4.003 7 g，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4 h，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5 mL使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm，柱高12 cm），以水50 mL洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30 mL洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，0.45 ?m微孔滤膜过滤，即得[10]。

2.2.4 益气活血方醇提供试品溶液的制备

精密吸取按“2.1”项下方法制备的益气活血方醇提液100 mL，水浴蒸干，残渣加水10 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇萃取4次，每次30 mL，合并正丁醇萃取液，用氨试液充分洗涤2次，每次40 mL，再用蒸馏水30 mL洗涤1次，弃去水层，正丁醇液置水浴上蒸至近干，残渣加甲醇溶解后定容至5 mL容量瓶中，摇匀，0.45 ?m微孔滤膜过滤，即得[11-12]。

2.2.5 阴性对照溶液的制备

取不含黄芪的益气活血方药物饮片，按“2.2.4”项下方法制备，即得。

2.2.6 专属性试验

精密吸取上述对照品溶液、益气活血方醇提供试品溶液和阴性对照溶液各10 ?L，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果见图1。阴性对照溶液色谱图中未见黄芪甲苷色谱峰，表明阴性无干扰。

2.2.7 线性关系考察

精密吸取黄芪甲苷对照品溶液1、5、10、15、20、25 ?L，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以进样量的自然对数为横坐标，以对照品峰面积的自然对数为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=1.479X+17.363（r2=0.992），表明黄芪甲苷在0.49～12.11 ?g范围内线性关系良好。

2.2.8 精密度试验

精密吸取黄芪甲苷对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次，每次10 ?L，黃芪甲苷峰面积RSD=1.24%，表明仪器精密度良好。

2.2.9 重复性试验

取同一醇提工艺条件的益气活血方醇提液，按“2.2.4”项下方法制备6份供试品溶液，分别按“2.2.1”项下色谱条件进样，结果黄芪甲苷含量RSD=0.79 %，表明方法重复性良好。

2.2.10 稳定性试验

取同一益气活血方醇提供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，于0、3、6、9、12、24 h测定，结果黄芪甲苷含量RSD=1.20%，表明益气活血方醇提供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.11 加样回收率试验

取已知黄芪甲苷含量的益气活血方醇提供试品溶液6份，每份1 mL，精密加入黄芪甲苷对照品0.2 mg，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算得黄芪甲苷平均加样回收率为96.74%，RSD=1.68%，表明本法准确性良好。

2.2.12 黄芪甲苷转移率的计算

分别精密吸取黄芪甲苷对照品溶液10、20 ?L，及黄芪供试品溶液和益气活血方醇提供试品溶液各10 ?L，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，采用外标两点法分别计算黄芪中黄芪甲苷含量（M0）和益气活血方醇提液中黄芪甲苷含量（M），并计算益气活血方醇提液中黄芪甲苷的转移率（y1）。y1=M/M0 ×100%。

2.3 丹参酮类转移率测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱为Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）;流动相A为乙腈，B为0.02%磷酸溶液，按表1进行梯度洗脱;柱温20 ℃;检测波长270 nm。理论板数按丹参酮ⅡA峰计算均不低于60 000。

2.3.2 对照品溶液的制备

精密称取丹参酮ⅡA对照品1.0 mg于50 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，即得浓度为20 ?g/mL的丹参酮ⅡA对照品溶液。

2.3.3 丹参供试品溶液的制备

精密称取丹参粉末（过3号筛）0.300 5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率140 W，频率42 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得[10]。

2.3.4 阴性对照溶液的制备

取不含丹参的益气活血方药物饮片，按“2.1”项下方法制备，即得。

2.3.5 专属性试验

精密吸取丹参酮ⅡA对照品溶液、益气活血方醇提供试品溶液和阴性对照溶液各10 ?L，按“2.3.1”项下色谱条件测定，以丹参酮ⅡA对照品为参照，以其相应的峰为S峰，计算隐丹参酮、丹参酮Ⅰ的相对保留时间。结果见图2。阴性对照溶液色谱图中未见丹参酮类色谱峰，表明阴性无干扰。

2.3.6 线性关系考察

精密吸取100 ?g/mL丹参酮ⅡA对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，分别精密吸取10 ?L，按“2.3.1”项下色谱条件测定，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行回归，得回归方程Y=37.447X+21.943（r2=0.999 1），表明丹参酮ⅡA在10～100 ?g/mL范围内线性关系良好。

2.3.7 精密度试验

精密吸取丹参酮ⅡA对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件重复进样6次，每次10 ?L，丹参酮ⅡA峰面积RSD=0.73%，表明仪器精密度良好。

2.3.8 重复性试验

取同一醇提工艺条件的益气活血方醇提液，分别按“2.3.1”项下色谱条件进样，结果丹参酮ⅡA峰面积RSD=1.09%，表明方法重复性良好。

2.3.9 稳定性试验

取同一醇提工艺条件的益气活血方醇提液，按“2.3.1”项下色谱条件，于0、3、6、9、12、24 h测定，结果丹参酮ⅡA峰面积RSD=0.77%，表明益气活血方醇提液在24 h内稳定。

2.3.10 加样回收率试验

取已知丹参酮ⅡA含量的益气活血方醇提液6份，每份10 mL，精密加入丹参酮ⅡA对照品0.6 mg，按“2.3.1”项下色谱条件测定，计算得丹参酮ⅡA的平均加样回收率为97.54%，RSD=1.01%，表明本法准确性良好。

2.3.11 丹参酮类转移率的计算

精密吸取丹参酮ⅡA对照品溶液、丹参供试品溶液和益气活血方醇提供试品溶液各10 ?L，按“2.3.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，分别计算丹参中丹参酮类总含量（N0）和益气活血方醇提液中丹参酮类总含量（N），并计算益气活血方醇提液中丹参酮类的转移率（y2）。y2=N/N0×100%。

2.4 浸膏得率测定

精密吸取“2.1”项下益气活血方醇提液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃真空干燥3 h，置干燥器中冷却0.5 h，迅速称重，计算浸膏得率（y3）。y3=残渣质量×提取液总体积÷（移取供试液体积×提取药物饮片总质量）×100%。

2.5 多指标组合赋权

2.5.1 G1赋权法

G1赋权法是在层次分析法（AHP）基础上改进的一种主观赋权法，较AHP具有计算速度快、无需一致性检验的优点[13]。依据益气活血方配伍原则和功效相关药效物质，确定益气活血方醇提工艺3个评价指标的顺序为y1>y2>y3，且相邻指标的权重评价标度为r2（y1与y2）=1.2，r3（y2与y3）=1.6，按公式（1）（2）计算指标的权重系数wk。

2.5.2 信息熵权法

信息熵权法是一种根据各指标原始数据所提供信息量的大小来确定各指标权重的客观赋权法[14]。该指标的原始数据差异越大，其熵值越小，提供的信息量就越大，其在综合评价中所起的作用也越大，即所占权重就越大，反之，其所占权重就越小[15-16]。采用EvaGear1.1.6820软件分别计算益气活血方醇提工艺3个评价指标的权重系数wh。

2.5.3 组合权重的确定

设由G1赋权法得到的主观权重为w1，信息熵权法得到的客观权重为w2，按公式（3）计算指标的组合权重w[17]。

2.6 提取次数考察

称取益气活血方醇提药物饮片共120 g，第1次以7倍量70%乙醇提取90 min，第2次以5倍量70%乙醇提取60 min，第3次以5倍量70%乙醇提取60 min，分别测定各次提取的黄芪甲苷转移率、丹参酮类转移率及浸膏得率。结果表明，3个指标第3次提取占总提取比例分别为4.39%、4.25%和11.33%，因黄芪甲苷和丹参酮类转移率为重要指标，且第3次提取占总提取比例均小于10%，故最终确定提取次数为2次。

2.7 响应面试验及结果分析

2.7.1 响应面试验设计

在预试验和单因素试验基础上，选取乙醇体积分数（A）、乙醇用量（B）、提取时间（C）为自变量，每个自变量按低、中、高水平进行-1、0、1编码，以综合评分（Y）为响应值，进行三因素三水平Box-Behnken设计，因素水平见表2。

2.7.2 响应面试验结果与分析

采用多指标赋权法得到益气活血方醇提各指标的组合权重，并按公式（4）计算各试验条件的指标综合评分P。益气活血方醇提工艺各评价指标组合权重见表3，试验结果见表4。采用Design-Expert10.0.7软件对表4數据进行分析，拟合得到自变量A、B、C与响应值Y之间的二次多项回归方程Y=130.19-4.33A-0.078B-0.28C+0.16AB+5.93×10-3AC+3.56×10-3BC+0.03A2-0.26B2-1.08×10-4C2。对上述回归模型进行显著性检验，结果见表5。

2.7.3 响应面预测与工艺验证

采用Design-Expert10.0.7软件与Box-behnken设计-响应面法预测的最佳工艺参数为乙醇体积分数70%、乙醇用量14倍（8倍和6倍）、提取时间210 min（120 min和90 min），综合评分为97.69。进行3次平行验证试验，结果见表6，平均综合评分为95.79，RSD=0.74%，与预测值相差不大，且稳定，表明该提取工艺稳定可靠。

3 讨论

本研究中黄芪甲苷转移率测定时益气活血方醇提供试品溶液制备采用水饱和正丁醇萃取和氨试液洗涤的前处理方法。有文献报道萃取时间和次数、碱洗时间和次数，以及每次萃取和碱洗所用的水饱和正丁醇和氨试液对黄芪甲苷含量测定结果均有影响，尤其氨试液洗涤是很关键的一步[18]。故水饱和的正丁醇萃取和氨试液洗涤不完全充分可能是本研究中黄芪甲苷转移率偏低的原因。

中药复方成分复杂，采用单一指标评价复方的内在质量具有极大的片面性，因此，本研究依据益气活血方配伍原则和功效相关药效物质，选择黄芪甲苷转移率、丹参酮类转移率和浸膏得率3个指标作为益气活血方醇提工艺的评价指标，能够较合理地优选出其最佳工艺参数。

多指标评价中药复方提取工艺时最关键是权重系数的确定，目前主要有主观赋权和客观赋权两大类确定权重的方法。G1赋权法是在AHP基础上改进的一种主观赋权法，信息熵权法是一种根据各指标原始数据所提供信息量的大小而确定各指标权重的客觀赋权法。本研究采用G1法和熵权法的组合赋权，既可避免主观随意性，又可增强各指标的内在联系，使益气活血方醇提工艺的多指标综合评价结果更加合理，同时结合响应面设计将各因素和各指标的综合评分函数化，能简单准确地对益气活血方醇提工艺参数进行优选。

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