日本鳗鲡嗜水气单胞菌的分离鉴定与免疫相关基因变化的研究

2019-09-02翟少伟冯建军江兴龙肖益群郭松林

集美大学学报（自然科学版） 2019年4期

何乐,翟少伟,冯建军，江兴龙,肖益群,郭松林

(1.集美大学水产学院，福建厦门 361021;2.鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建厦门 361021)

0 引言

鳗(Anguillaspp.),俗称鳗鲡,隶属于鳗鲡目鳗鲡科。鳗鲡广泛分布于全球热带、亚热带和温带地区[1]，是中国重要的出口创汇农产品之一[2]。日本鳗鲡(Anguillajaponica)经济价值高、味道鲜美、营养丰富，深受我国和日本市场的欢迎。由于日本鳗鲡的苗种过度依赖于捕捞，近年来该物种年产量严重下降[3]。实际上，集约化养殖导致日本鳗鲡细菌性疾病的发生日益频繁，因此也严重影响了鳗鲡的养成[4]。嗜水气单胞菌是鳗鲡重要的致病菌，常见鳗鲡感染后出现败血症的报道[5]。

有研究表明，真骨鱼类的免疫反应过程受多个基因的调控[6]，这些基因被称为免疫相关基因。近年来，通过对鱼类接种灭活疫苗的研究发现了一些抗细菌感染相关的基因。使用福尔马林灭活的柱状黄杆菌免疫草鱼(Ctenopharyngodonidellus)后，其肝、脾和头肾中的主要组织相容性抗原(mhc-Ⅰ)、肿瘤坏死因子(tnf-α)、白细胞介素(il-1β)和干扰素(ifn-Ⅰ)等4种基因的表达水平均发生不同程度的变化[7]。有人将嗜水气单胞菌和大肠杆菌粗制脂多糖分别经腹腔注射草鱼，结果发现，免疫组草鱼头肾、脾脏、肾脏、肝脏和肠组织中多种免疫相关基因均出现不同程度的变化[6]。已有的研究大多是通过人工感染鱼类得到tnf-α、tlr4和lysC等相关免疫基因的变化[6，8]，而日本鳗鲡的cox2基因虽然已经获得，但是没有进一步的研究。迄今为止，未见日本鳗鲡自然感染嗜水气单胞菌后对其免疫相关基因表达水平影响的相关报道。

由于患细菌性疾病的养殖鳗鲡常死于自然感染，故研究日本鳗鲡自然状态下被细菌感染后的抗感染机制具有重要意义。本研究从自然发病的养殖日本鳗鲡脾脏中分离到1株嗜水气单胞菌，以自然感染嗜水气单胞菌前后的日本鳗鲡不同组织的cDNA为模板，研究已知的日本鳗鲡4种免疫相关基因的变化水平，为鳗鲡抵抗嗜水气单胞菌感染的相关机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本来源

100尾健康的日本鳗鲡购自福建省福清市某养殖场，体重约为(50±10)g。分别饲养于集美大学疫苗中心的4个水族箱中，每箱25尾，每天换水，全天24 h充氧，水温控制在25 ℃左右。投饵量为鳗鲡体重的0.5%，每天投喂1次。鳗鲡饲养5 d后，取5条鳗鲡作为健康鳗鲡的cDNA模板。鳗鲡饲养约14 d后发现30%的日本鳗鲡出现脱黏症状(见图1)。取5尾出现明显症状的发病鳗鲡用于模板cDNA的分离。

1.2 细菌的分离与培养

无菌操作下，用接种环挑取自然感染且具有典型患病症状的日本鳗鲡脾脏组织直接接种于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板上(接种过程在超净工作台中严格按照操作流程进行无菌操作)，30 ℃孵育24 h后，挑取平板上的单菌落，并在TSA上划线以获得细菌的纯培养，将纯化的细菌菌落保存于TSA琼脂试管斜面，同时将其余纯培养物移至含有20%甘油的TSB肉汤中，置于-70 ℃冻存。

1.3 分离菌株的16S rRNA基因序列系统发育分析

1.3.1 细菌基因组DNA的提取

将分离到的细菌接种于培养基中(TSB)，于摇床中培养24 h(30 ℃)。取适量菌液(1 mL)，离心5 min(12 000 r/min)后弃上清。按照基因组DNA提取试剂盒(GENERAY，上海)的操作手册，提取细菌基因组。

1.3.2 16S rRNA基因的扩增及PCR产物的纯化

参考相关文献[9]，使用通用引物扩增分离菌的16S rRNA基因片段。引物(GENERAY，上海)分别为27F :5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。采用ExTaq聚合酶PCR反应试剂盒进行PCR扩增，PCR反应条件为:首先95 ℃预变性5 min；然后进行35个循环，分别为95 ℃(30 s)，55 ℃(30 s)，72 ℃(60 s)；最后72 ℃彻底延伸7 min。反应完成后，待1.5%的琼脂糖凝胶电泳后切下目的条带，按照柱式DNA胶回收试剂盒的操作步骤回收PCR 产物(GENERAY，上海)。回收产物送至厦门铂瑞生物科技有限公司进行测序分析。

表1 Real time PCR中所用引物

1.3.3 序列分析与数据处理

使用BLAST检索工具对分离菌的16S rRNA基因序列在GenBank数据库中进行相似性比对分析(NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。选取其中8种嗜水气单胞菌和18种本实验室分离到的气单胞菌序列，并且根据《伯杰氏细菌鉴定手册》选取了19种其他种类的气单胞菌序列[10]，然后使用MEGA 5.0软件，通过邻接法[11]建立细菌的系统发育树。

1.4 细菌生理生化鉴定

根据杭州滨和微生物有限公司的细菌微量生化反应管使用说明，首先参考文献[12]对细菌纯化培养物基本生理指标进行初步测定，包括：葡萄糖产气、七叶苷、赖氨酸、精氨酸、甘露醇、蔗糖、V-P反应、纤维二糖和鸟氨酸，然后通过使用Biolog微孔板(Biolog，美国)进行物种水平的鉴定。简而言之，让纯化的细菌在Biolog专用培养基琼脂平板上生长。从琼脂平板表面选取1个细菌单菌落，并在配套的接种液(IF-A)中悬浮至一定浓度。采用12道加样枪将细菌悬浮液移到专用的96孔微孔培养板中(100 μL/孔)。微孔板置于生化培养箱，30 ℃孵育24 h。用BiologMicroStationTM系统读取微板并与数据库中已有细菌的95个生化指标进行比较，从而根据相似性鉴定细菌。

1.5 免疫相关基因的表达分析

分别取5尾健康和5尾患病的日本鳗鲡，用1×10-5的丁香酚麻醉后，迅速取粘液、肝、脾、肾等组织置于RNA保护液(TIANGEN,北京)中，并转移至超低温冰箱中保存备用。采用RNA 提取试剂盒(Promega，美国)提取各组织的总RNA，将总RNA样品进行DNA酶I处理，运用核酸测定仪和1.0%的琼脂电泳检测总RNA样品的浓度和纯度。然后采用PrimeScriptTM第一链cDNA试剂盒(Promega，美国)合成cDNA(操作过程参考说明书)，合成的cDNA保存于-70 ℃。在定量板中加入配制好的10 μL反应体系：SYBR GreenSuperMix 5 μL，超纯水3.6 μL，cDNA模板1 μL，正向和反向引物(见表1)各0.2 μL。根据说明书在LightCycle480系统(Roche，德国)上进行所有样品的扩增，简而言之，将10 μL的反应体系95 ℃预变性30 s，然后进行40个循环(分别为95 ℃，10 s；55 ℃，25 s；72 ℃，15 s)，最后72 ℃延伸10 min。所得试验原始数据采用2-△△Ct法处理完成后，将处理完成后的数据用SPSS 22.0进行单因素方差分析，以所得数据的平均值±标准误(mean±S.E)为依据作图。

2 结果

2.1 分离菌株的形态特征

分离菌株在TSA平板上菌落呈淡黄色、圆形，且边缘整齐(见图2)。在电镜下观察到其菌落形态呈短杆状，类似椭圆形，具极生鞭毛(见图3)。

2.2 分离菌株的16S rRNA基因序列的系统发育分析

将基因测序得到的分离菌的16S rRNA部分基因序列，通过NCBI-blast进行相似性比对后，发现分离菌与嗜水气单胞菌的相似性(99%)最高，系统发育树的结果也显示了分离菌与嗜水气单胞菌聚在一组中(见图4)。

2.3 分离菌株的生理生化鉴定

本次研究对分离菌进行初步检测的结果为葡萄糖产气，七叶苷、赖氨酸、精氨酸、甘露醇、蔗糖和V-P反应为阳性，纤维二糖和鸟氨酸为阴性。而Biolog自动微生物鉴定系统鉴定分离菌与嗜水气单胞菌的鉴定可能性(PROB)为0.589，相似性指数(SIM)为0.589，位距(DIST)为6.037，嗜水气单胞菌部分特征性生理生化指标见表2。结合分子鉴定结果确定该分离菌为嗜水气单胞菌。

2.4 免疫基因表达分析

在肝脏中，各基因的表达如图5a表示，与自然状态(健康状态)相比，tlr3基本没有变化，tnf有一定程度的上调，cox2和lysC呈现一定程度的下降。在脾脏中，各基因的表达如图5b表示，tlr3、tnf-α和cox2都呈现出一定程度的上调，lysC出现显著性的上调。在肾脏中，各基因的表达如图5c表示，tlr3、tnf-α和cox2呈现出一定程度的上调，lysC出现显著性的上调。在粘液中，各基因的表达如图5d表示，tlr3、cox2和lysC呈现出一定程度的上调,tnf出现一定程度的下降。

表2 分离菌与嗜水气单胞菌的生化特征

说明：“+”为阳性；“-”为阴性；“B”为临界值。

Notes:“+”is postive；“-”is negative；“B”is borderline.

3 讨论

3.1 嗜水气单胞菌的危害

嗜水气单胞菌隶属于气单胞菌科(Aeromonadaceae)气单胞菌属(Aeromonas)，可以感染一系列脊椎动物，包括人类、爬行动物和鱼类[13]，是水产养殖中常见的病原菌。该菌可引起水产动物出现败血症，而且还常与其他病原菌共同感染，已经对水产养殖业造成了严重的经济损失[14]。近年来，关于青鱼(Mylopharyngodonpiceus)[15]、黄沙鳖(Truogxsinensis)[16]、红点鲑(Salvelinusfominalis)[17]受嗜水气单胞菌感染并且致病的研究已有报道。

3.2 分离菌株的鉴定

现今鉴定微生物最常用的方法就是生化鉴定和16S rRNA基因的序列分析。由于16S rRNA基因在细菌菌属(种)内高度保守，几乎可以对所有的细菌鉴定到属[18]，但是由于其对同源种类无法准确区分，不能准确反映关系较近的物种间的关系[19]，所以需要其他鉴定方法作进一步的鉴定。Biolog自动微生物鉴定系统检测细菌的原理是通过细菌对糖、醇、酸、醋、胺和大分子聚合物等95种碳源的利用情况进行判定[20]，多应用于土壤和环境中微生物的检测[21]，此方法快速、简单，并且省却了配多种培养基的工作。本研究从患病的日本鳗鲡脾脏中分离纯化得到一株优势菌株，在16S rRNA基因系统发育树中，显示B101菌株与已报道的嗜水气单胞菌聚为一支，但是与本实验室分离到的B50、B31、B32和B11没有聚到一起，推测可能是细菌来源与毒力差异所致。分离菌的初步生理生化鉴定结果显示葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇等嗜水气单胞菌的重要鉴定指标均与杨宁等[22]的鉴定结果一致。Biolog鉴定结果中有3种重要的参数，即PROB值、SIM值和DIST值，其中SIM值≥0.75，DIST值≤0.50，PROB值越接近1越好[23]，而本次研究结果显示分离菌与嗜水气单胞菌的PROB值为0.589，SIM值为0.589，DIST值为6.237。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[10]发现分离菌株的蔗糖、纤维二糖、水杨甙、山梨醇、醋酸、柠檬酸和果胶均与嗜水气单胞菌不同，而葡萄糖、D-麦芽糖、甘露糖、甘露醇、明胶、麦芽糖、棉子糖、乳糖和葡萄糖苷等重要指标的鉴定结果与嗜水气单胞菌的一致，说明Biolog系统虽鉴定结果为嗜水气单胞菌，但还存在一些差异。由于Biolog鉴定系统的参考菌株来自欧美等国，故这些差异很可能源于菌株来源的地域差异。结合本研究的生化鉴定和分子生物学鉴定结果，可以确定分离菌株为嗜水气单胞菌。

3.3 嗜水气单胞菌自然感染后对免疫相关基因表达的影响

鱼类免疫系统的主要功能是帮助机体识别和清除异物，以及防御和维护自身稳定。鱼类作为低等脊椎动物，同样具有非特异性和特异性免疫应答机制[24]。本次研究选取健康和自然感染嗜水气单胞菌的日本鳗鲡组织作为cDNA模板，进行荧光定量PCR，检测tlr3、tnf-α、lysC和cox2免疫基因的变化。tlr3位于细胞器膜上,是一种重要的病毒识别受体[25]，是由T细胞分泌的，可以参与机体炎症与免疫应答的调节，有发挥促进细胞进行一系列新陈代谢的作用[26]。本次研究结果显示日本鳗鲡在感染嗜水气单胞菌后tlr3和tnf-α基本没有显著性的变化。Liu等[27]的研究结果表明牙鲆(Paralichthysolivaceus)和虹鳟(Oncorhynchusmykiss)感染嗜水气单胞菌后，tlr3没有显著性的变化。彭小云等[6]研究发现草鱼在注射嗜水气单胞菌粗脂多糖后，其tnf-α也没有显著性的变化。本研究表明自然感染嗜水气单胞菌的日本鳗鲡tlr3和tnf-α不会产生显著性变化。溶菌酶被认为是鱼类中重要的抗菌分子之一，可以在机体免疫过程中加快细菌的死亡[28],而C型是溶菌酶的一个类型。本研究结果显示lysC在病鳗的不同组织中呈现不同程度的上调，尤其是在肾脏和脾脏中出现显著性的升高，Ye等[8]曾研究过草鱼在感染嗜水气单胞菌后lysC在不同组织中出现一定程度的上调，推测这是由于物种或者感染途径不同所致。cox2参与许多生物学和病理学过程，例如细胞的新陈代谢、免疫应答和防止外来物质入侵[29]。本研究结果显示自然感染嗜水气单胞菌的日本鳗鲡cox2不会产生显著变化。cox2在鱼类中感染嗜水气单胞菌的研究较少，有待进一步的研究。