VEGF 基因沉默对人肺癌A549 细胞放射增敏作用的体内研究

马 军, 罗居东, 景文江, 张淑莲, 王娟毅, 范志刚

(1. 汉中三二〇一医院肿瘤科, 汉中 723000；

2. 南京医科大学附属常州第二人民医院肿瘤中心, 常州 213164)

作为肿瘤治疗的主要手段，放射治疗广泛应用于多种肿瘤[1]。肺癌是死亡率增长最快的恶性肿瘤，它的发病率也一直在全世界占据首位[2～4]，肺腺癌属于非小细胞肺癌，约占所有肺癌的80%,约75%的患者在确诊时已处于中晚期，5 年生存率很低[5～8]。恶性肿瘤对射线的敏感性不高，即使接受高剂量射线，仍不能得到理想效果[9]。因此如何提高其放射敏感性成为重要研究课题。

目前，基因沉默结合放射治疗已成为肿瘤治疗的新趋势[10]。在鼻咽癌、结肠癌、皮肤鳞状细胞癌等肿瘤中, 关于通过干扰沉默血管内皮生长因子(VEGF)基因来治疗的研究已经有报道[11-13]。干扰VEGF 基因的方式在多种肿瘤中呈现明显的抑制作用[14-17]。然而，关于siVEGF 对肺癌细胞放射敏感性的影响尚未报道。本研究通过建立A549荷瘤鼠模型, 利用体内沉默VEGF基因的技术手段, 验证siVEGF对放射治疗非小细胞性肺癌敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要仪器设备

5周龄雌性BALB/C-nu裸小鼠, 体质量17～18 g,购自广州中医药大学实验动物中心[SCXK(粤)2013-0034]。A549细胞系购自ATCC, PCMV-VEGF siRNA 沉默质粒由上海吉玛制药技术公司设计构建，RNAi-MateTM转染试剂购自上海吉玛制药技术公司, VEGF、β-actin 抗体购自Santa Crus 公司,q-PCR仪器采用美国ABI公司 7900HT型PCR仪。

1.2 方法

1 .2.1 细胞培养 人肺腺癌A549细胞株培养于含有10%胎牛血清及青霉素和链霉素(100 IU/mL)的RPMl 1640 培养基。7 ℃、体积分数5% CO2培养箱中进行细胞培养，当细胞生长融合度为七八成时候进行细胞传代。细胞实验选用正处于对数生长期细胞。

1.2.2 小鼠肿瘤模型的建立 胰酶消化对数生长的A549 细胞, 完全培养基终止消化。收集细胞并用无菌预冷的PBS 清洗2 次。细胞计数并且用PBS 重悬, 调整细胞的浓度为1×107/mL。200 μL均匀的细胞悬液注射于裸小鼠左后背部皮下。40 只裸小鼠共分为4 组，空白质粒对照组、放疗组、VEGF 基因沉默组、VEGF 基因沉默+放疗组，每组10 只。以皮下结节长径超过0.5 cm为成瘤标准。接种当日为1 d，接种7 d 后达到成瘤标准，即为荷瘤小鼠，用于实验。

1.2.3 目标基因序列的选择及siRNA序列设计 目标基因靶序列是按照siRNA 设计原则，在基因编码区进行选择。然后设计特异性干扰序列，宁合成VEGF siRNA 正、反义寡核普酸链。无意义序列的干扰序列作为实验对照(siMock)(表1)。

表 1 siVEGF 基因序列Table 1 The gene sequence of siVEGF

1.2.4 体内质粒转染 将荷瘤鼠随机分为4组： 空白对照组(siMock)； 单纯siVEGF 组； 单纯放疗组；siVEGF 加放疗组。将10 μg siVEGF 及siMock 质粒分别与30 μg RNAi-MateTM转染试剂于150 μL无血清的1640培养基混匀待用。采用瘤内局部多点注射法, 每次150 μL/只，7 d 重复注射一次, 共3 次。对照组和单纯放疗组注射siMock/RNAi-MateTM混合物； 单纯siVEGF组和siVEGF加放疗组注射siVEGF/RNAi-MateTM混合物，各放疗组分别在最后一次给药后2 d 进行照射。

1.2.5 放疗条件 首先将裸小鼠固定, 使用铅板对裸小鼠的除肿瘤外的其他部位进行防护。用美国VARIAN 2300C/D型双光子直线加速器(300 cGy/min,4 Gy)局部照射肿瘤。

1.2.6 动物模型测量及HE 染色 按照动物饲养规定和动物伦理按规饲养裸小鼠。每日测量裸小鼠肿瘤大小(长径和短径)并计算肿瘤体积，检测肿瘤的生长。肿瘤体积计算公式为V=0.5 a×b2(a 是长径，b 是短径)。放射治疗当日为实验1 d，经放射治疗后，即实验24 d 给裸小鼠施行安死术，收集各组裸小鼠完整肿瘤组织用于后续实验。其中，部分组织固定后，石蜡包埋，常规切片，伊红、苏木素进行H E 染色。

1.2.7 Q-PCR 检测转染后VEGF 的mRNA 表达收集肿瘤组织，T r i z o l 对组织进行裂解提取RNA。1 μg 总RNA 用于逆转录成cDNA，再以cDNA 为模板，采用Taq PCR MasterMIx 试剂进行PCR 扩增反应。VEGF 的上游引物序列为： 5'-TGCCTAG-ATCTCTCCAGAGAT-3', 下游引物序列为： 5'-TCG-TGCATATGTGCTTCTAC-3', 扩增长度为322 bp。PCR 扩增反应条件如下： 98 ℃变性10 s、56 ℃退火30 s 和72 ℃延伸35 s, 循环30 次；再72℃延伸10 min。实时定量 PCR 的结果采用2-△△Ct法进行计算, 用内参基因β-actin对各基因表达水平均一化, 2-△△Ct法计算公式： △Ct = Ct目的基因- Ct内参基因，△△Ct = △Ct实验组- △Ct对照组。每组实验至少重复3 次。

1.2.8 Western blotting 检测转染后VEGF的蛋白表达 各组肿瘤组织剪碎并用组织裂解液裂解，Bradford 法测量蛋白质浓度。取各样本20 μg 的蛋白匀浆液进行SDS-PAGE 电泳，湿转将蛋白转移至PVDF 膜，5% BSA 封闭后，分别加入兔抗鼠多克隆一抗VEGF (1∶1 000)，4 ℃，12 h。回收一抗并洗膜，HRP 标记的二抗孵育1 h，用ECL 发光法检测蛋白条带，以β-actin作为内参进行标准对照。每组实验至少重复3 次。1.2.9 免疫组织化学检测转染后VEGF 的蛋白表达 取各组肿瘤组织, 质量分数4%多聚甲醛溶液中固定, 蔗糖梯度脱水24 h, 常规石蜡切片, 脱蜡后, 在枸橼酸钠缓冲溶液中进行高压抗原修复, 3%双氧水阻断内源性过氧化物酶后, 正常血清封闭，4℃孵育在含有VEGF(1∶200)抗体工作液12 h。之后使用生物素标记的二抗和HRP标记链霉卵白素工作液，孵育30 min 后。之后经过清洗, 显色,复染和封闭后进行观察。原始实验数据的判读方式： 判读的胞核、胞浆染色的染色强度(0/1+/2+/3+)和染色阳性率。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0 软件进行数据统计分析，各组数据采用t 检验，免疫组织化学评分数据采用秩和检验，计量数据用x-± s 表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siVEGF合并放疗对肿瘤生长的影响

裸小鼠荷瘤生长曲线结果显示： 裸小鼠皮下移植A549 细胞后，随着时间的延长，各组肿瘤体积都增加, 相对于对照组, siVEGF单独组和放疗单独组的肿瘤生长均有被抑制趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。但是siVEGF与放疗联合治疗组的肿瘤生长却被明显抑制, 至20～24 d差异更明显(P＜0.01)(图1A)，而各组体质量相差不大(图1B),裸小鼠大体及皮下瘤组织照片见图1C。

2.2 RT-PCR和Western blotting 分别检测VEGF的mRNA 和蛋白的表达

处死质粒转染后的荷瘤鼠，取肿瘤组织，组织匀浆后，分别做RT-PCR 和Western blotting。结果表明：siVEGF 组相对于siRNA-Mock 组，VEGF mRNA 水平和蛋白水平有明显下降，P＜0.05，说明质粒体内转染成功(如图2)。

2.3 免疫组织化学检测VEGF的表达

VEGF 的免疫组织化学检测表明, 与siMock组相比, siVEGF转染组以及合并放疗组, VEGF表达明显降低, 即棕色颗粒显色程度明显降低(P＜0.05)；而单独放疗组，VEGF 的下降并不明显。这进一步表明s i V E G F 质粒转染成功，同时，可见siVEGF 合并放疗组肿瘤坏死组织增加(图3)。

A： Q-PCR 验证VEGF 的mRNA 水平变化； B： Western blotting 验证VEGF 的蛋白水平变化； 与对照组比较, #P＜0.01图 2 siVEGF 体内转染成功Figure 2 siVEGF was successfully transfected in vivo

A： 质粒转染对照组； B： 单纯放疗组； C： siVEGF转染组； D： siVEGF转染加放疗组； Bar=20 μm图 3 免疫组织化学检测VEGF 的蛋白表达Figure 3 Immunohistociemical staining detect tie expression of VEGF protein

2.4 siVEGF 合并放疗对肿瘤坏死面积的影响

通过镜下测量各个肿瘤坏死区域长径和短径用以估算肿瘤坏死面积。对肿瘤坏死面积的分析表明，与对照组比较, 单纯siVEGF 转染组肿瘤坏死面积增加不明显, 单纯放射组肿瘤坏死面积明显增加(P＜0.05), 说明放疗有效果。而siVEGF 联合放射组显著增加了肿瘤坏死面积(P＜0.01)(图4A)。HE 染色显示，坏死样组织细胞缩小，碎裂，细胞凋亡明显(图4B)。

3 讨论

作为最常见的高发病率、高死亡率的一种癌症，全球每年大约有150 万人被诊断为肺癌[1]。癌症的发病率高复发和转移是肺癌治疗失败的两个主要原因。对晚期或转移性肺癌患者进行局部放疗和化疗是通常的治疗方法。肿瘤的发生和发展是一个逐渐演化的多因素协同作用的长期过程，其中肿瘤的血管生成对于肺癌的生长和转移起到关键作用。因而，靶向肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤发展的思路显得尤为重要。

VEGF 是一种活性很强的血管发生和血管生成生成生长因子，与肿瘤的生长、转移和预后密切相关。多种肿瘤中VEGF 的水平与患者5 年存活呈负相关的关系； 多种组织类型的肿瘤细胞分泌VEGF, 通过旁泌生长刺激来引发内皮细胞增殖及血管形成, 促进肿瘤的增殖[18]。在肿瘤放疗过程中, VEGF 对辐射后血管再生起着重要的作用[19]。另外，VEGF可以协同抗凋亡蛋白Bcl-2抑制内皮细胞凋亡, 促进血管生成，进而产生放射治疗的抵抗[20]。研究[21]表明肿瘤微环境中，缺氧能够明显诱导VEGF 的产生，而且，肿瘤在放疗过程中进一步增强了微环境的乏氧程度，促进了VEGF的分泌，进而促进了血管生成和肿瘤细胞对放疗射线的抵抗。正是因为VEGF 在肿瘤的发生发展以及放射敏感性的重要作用，VEGF 的靶向与肿瘤放疗联合疗法表现出诱人的治疗前景。

A： 肿瘤坏死面积的定量分析, 与对照组比较, *P＜0.05, #P＜0.01；B： H&E 染色, 1～4 分别为对照组、siVEGF 转染组、放疗组和siVEGF 转染加放疗组图 4 siVEGF 合并放疗增加肿瘤坏死面积Figure 4 siVEGF transfected and radiotherapy increase the necrotic area of tumor

非小细胞性肺癌恶性程度高，一般发现较晚，放疗是其重要治疗手段之一。如何增加肿瘤细胞的放射敏感性一直是放疗研究的热点和重点。作为一种转录后调控的方式，RNA 干扰通过与目的基因同源的小干扰RNA在靶细胞内形成诱导沉默复合体, 选择性降解目标基因mRNA, 进而有效降低目的基因的表达[22]。siRNA 在基因沉默过程中具有特异性、精准性和高效性优点[23]。因此通过沉默VEGF 基因，降低肿瘤细胞VEGF基因的表达，增强肿瘤细胞的内在放射敏感性是一种新的增敏方式。在肺癌中沉默VEGF，可以起到抗肿瘤血管生成的作用[24,25]，同时沉默VEGF 可以增强鼻咽癌CNE-2 细胞对放射的敏感性[26], 同时, 抑制VEGF 可以增强光动力学疗法对头颈部肿瘤的治疗[27]。

本研究利用 RNA 干扰技术，沉默肺癌细胞中 VEGF 的表达, 并且成功地建立了A549裸小鼠荷瘤模型, 实验表明，siVEGF 能抑制体内肿瘤的生长, 而且没有观察到明显的毒副作用。siVEGF联合放疗组肿瘤生长明显抑制，且肿瘤组织有较多的坏死。Q-PCR、Western blotting、免疫组织化学检测表明, siVEGF 及siVEGF 配合放疗组，VEGF 的表达明显减弱。实验表明瘤内注射脂质体包裹的siVEGF 对A549 细胞有放射增敏作用，为临床开展针对VEGF 基因的靶向治疗和放射治疗的联合治疗非小细胞性肺癌提供了实验依据。