褐煤发酵制生物氢过程中关键液相产物的变化规律

夏大平 黄 松 张怀文

1.河南理工大学能源科学与工程学院 2.河南理工大学瓦斯地质与瓦斯治理国家重点实验室培育基地3.中原经济区煤层（页岩）气协同创新中心

0 引言

在对新能源的探索中，氢能因其易燃、高效、热值高等优点受到广泛关注[1-3]，而生物制氢技术因为反应条件温和且耗能少，被公认为是一种最有前途的方法[4-5]。生物质暗发酵产氢不仅可以处理有机废物，同时可以获得清洁能源，实现了废弃物资源化利用[6-9]。

煤制生物氢技术是利用矿井水中的混合菌群对煤炭进行暗发酵产氢，较之于利用纯菌种进行生物制氢，可减少菌种分离、DNA鉴定和扩大培养等一系列繁杂的技术和设备，在节约生产成本的同时，还提高了制氢工艺的可操作性，从技术层面更有利于工业化生产[10]。苏现波等通过在实验室模拟微生物发酵产气的过程，证实了煤在适宜条件下可以被微生物降解转化成H2和CH4[11]，同时微生物的活动能使煤的渗透性增强[12]，更有利于发酵液与发酵底物接触。夏大平等[13-15]利用葡萄糖用量、pH值、煤的用量及Fe2+浓度对产氢进行正交优化，从而确定了煤发酵产氢条件。长期以来，对煤厌氧发酵产氢的研究主要致力于提高产氢效率上，而对煤发酵产氢过程中液相中间产物内有机物的变化及相互转化关系却鲜有研究，而液相产物的种类和浓度不仅关系到煤转化成生物氢的效率，还是研究煤制生物氢生成机理的重要组成部分。

有学者[16-18]对发酵底物进行研究，发现中低阶煤由于其生物可利用性较强，在发酵产氢或产甲烷过程均效果显著。鉴于此，笔者采用陕西省大柳塔褐煤作为发酵底物，在实验室条件下模拟发酵产氢实验。运用气质联用仪（GC-MS）测试煤发酵产氢过程第1、3、6、9天的液相中间产物，以期为认识产氢过程液相有机物的变化和相互转化规律提供一定的实验依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料和仪器

1.1.1 煤样及菌种来源

煤样取自大柳塔褐煤，采样时取煤层开采处新鲜煤样。实验前将煤样破碎，筛选60～80目的粒度，灭菌处理后在真空干燥箱内80 ℃干燥24 h，放入干燥器内密封保存备用。取部分煤样进行工业分析测试，煤样的工业分析参照标准DL/T 1030-2006，其结果为：Mad=7.86%；Aad=10.90%；Vdaf=41.30%。菌种源自河南焦煤能源有限公司古汉山矿深层矿井水，取回后置于4 ℃实验室冰箱内密封保存备用。

1.1.2 培养基的制备

实验所用培养基是依据本文参考文献[19—21]所述产氢培养基，结合自身煤富集和厌氧产氢发酵过程，进行优选后确定的增产培养基。

产氢培养基组成（以1 000 mL为例）：NH4Cl，1.0 g；MgCl2·6H2O，0.1 g；K2HPO4·3H2O，0.4 g；NaCl，2.0 g；NaHCO3，2.0 g；胰化酪蛋白，1.0 g；酵母膏，1.0 g；葡萄糖，10.0 g；乙二胺四乙酸二钠，2.0 g；微量元素液，10 mL；复合维生素溶液，10 mL。

其中微量元素液组成：氨基三乙酸，1.50 g；MnSO4·2H2O，0.50 g；MgSO4·7H2O，3.00 g；FeSO4·7H2O，0.10 g；NaCl，1.00 g；CoCl2·6H2O，0.10 g；CaCl2·2H2O，0.10 g；CuSO4·5H2O，0.01 g；ZnSO4·7H2O，0.10 g；H3BO3，0.01 g；KAl (SO4)2，0.01 g；NiCl·6H2O，0.02 g；NaMoO4，0.01 g；蒸馏水 1 000 mL。

复合维生素溶液组成：生物素，2 mg；叶酸，2 mg；B6，10 mg；B2，5 mg；B1，5 mg；烟 酸，5 mg；泛酸钙，5 mg；B12，0.1 g；对氨基苯甲酸，5 mg；硫辛酸，5 mg；蒸馏水，1 000 mL。

将以上培养基加入到1 000 mL锥形瓶中，用10%的NaOH溶液调节pH值至7.0，再经高温灭菌锅灭菌后，加入0.5 g L-半胱氨酸盐酸盐及1 000 mL古汉山矿矿井水。充分混合并摇匀，充入氮气，制造无氧环境，密封，制备成产氢菌液。

1.1.3 实验仪器

实验仪器包括：粉碎机、电子天平、HVE-50高压灭菌锅（日本Hirayama公司）、氮气瓶、干燥箱、DHP-9082型电热恒温培养箱、马福炉、高速离心机、减压蒸馏装置、气相色谱—质谱联用仪。

1.2 实验方法

1.2.1 煤厌氧发酵产氢实验

将1 000 mL密封好的产氢菌液放入35 ℃恒温培养箱，富集4 d菌种，之后将产氢菌液平均分装在5个250 mL的锥形瓶内，并将20 g处理好的原煤加入锥形瓶中，充入氮气密封，在无菌厌氧环境下连接产气模拟装置（图1），连接完成后再次放入35 ℃恒温培养箱中培养，当无明显产气发生后结束产氢过程。在产氢过程中每隔1 d轻晃一次产气瓶，以保证产氢过程的高效进行。煤厌氧发酵产氢的气相产物每日测试1回。考虑到单日液相中间产物的变化不是很明显，所以分别在第1、3、6、9天取样测试。

1.2.2 萃取实验

将200 mL生物产氢发酵液平均分装在4支离心管中离心，离心结束后过滤发酵液，将滤液加入到125 mL的分液漏斗中，加入HCl，使pH值小于2。称取10 g NaCl（在马福炉550 ℃干燥4 h，放置干燥箱中备用）加入到分液漏斗中，搅拌使其充分溶解。吸取10 mL二氯甲烷加入到分液漏斗中，在常温下萃取10 min，然后收集分液漏斗下层有机相，重复上述操作2次，合并3次的萃取液，然后氮吹浓缩至干，加入2 mL二氯甲烷（CH2Cl2）溶解，过无水Na2SO4小柱干燥，供GC-MS分析。

1.2.3 GC-MS实验

GC-MS由安捷伦7890A型气相色谱仪与5795C质谱仪组成，色谱柱为VF-WAXms（30 m×250 μm×0.25 μm），采用程序升温：起始温度80 ℃（保持5 min）后以3 ℃/min升温至200 ℃，再以2 ℃/min升至300 ℃（保持10 min），汽化室温度300 ℃。质谱参数电子能量70 eV、离子源温度230 ℃、接口温度230 ℃，检测方式：全扫描方式，质量范围40～500 amu（amu为atomic mass unit的缩写，表示原子质量单位）。

小分子挥发性脂肪酸也采用安捷伦7890A型气相色谱仪进行检测，利用TCD检测器并配备Agilent CarbonPlot型色谱柱。利用气相色谱柱对注入液体进行分离，载气携带待测液体进入氢火焰离子化检测器的喷嘴口，并在色谱仪的含氧空气中灼烧，然后依次电离为正负离子，在离子室内形成的离子流被收集后，放大为电信号并经记录仪记录，微机处理，与标准进行比较，得出样品中各种组分的浓度。

2 结果和分析

2.1 产氢结果

大柳塔褐煤厌氧发酵产氢的单日产氢量、累计产氢量以及氢气浓度如图2所示，单日产氢量分别在第4天和第7天达到产气高峰，累计产氢量最终达到78 mL，氢气的最终产率为3.9 mL/g。氢气浓度呈现与产气量相近的变化趋势，在第6天浓度达到17.8%的峰值，当产气结束后，氢气浓度降至7%。

2.2 液相产物分析结果

分别对大柳塔褐煤厌氧发酵第1、3、6、9天的发酵液进行萃取和GC-MS测试，试验结果见图3。

图3-a为第1天煤厌氧发酵产氢液相产物GC-MS测试结果，所测出的成分主要包括芳香小分子酸类（苯乙酸，苯丙酸），酚类（对甲基苯酚，2,4-二叔丁基苯酚），脂肪酸类（棕榈酸），芥酸酰胺和2-吲哚酮以及一些复杂的化学物质[Cyclo(leucylprolyl)和邻苯二甲酸二异辛酯等]。

图3-b为第3天煤厌氧发酵产氢液相产物GC-MS测试结果，检测到的化学物质主要包括芳香小分子酸类（苯甲酸、苯乙酸、苯丙酸）、酚类（对甲基苯酚和2,4-二叔丁基苯酚）、脂类（邻苯二甲酸二异丁酯），正构烷烃（从正二十一烷到正三十三烷）、大分子酸以及一些化学结构复杂的物质[1,3-恶唑和Cyclo(leucylprolyl) 等 ]。

图3-c为第6天煤厌氧发酵产氢液相产物GC-MS测试结果，所检测出的化学物质包含芳香小分子酸类（苯甲酸、苯乙酸、苯丙酸）、酚类（对甲基苯酚，2,4-二叔丁基苯酚）、脂肪酸类（辛酸，棕榈酸），烷烃，油脂，酰胺（芥酸酰胺，戊内酰胺）、酮类以及一些结构复杂的化学物质[Cyclo(leucylprolyl)和邻苯二甲酸二异辛酯等]。

图3 -d为第9天煤厌氧发酵产氢液相产物GC-MS测试结果，所检测出的化学物质包含芳香小分子酸类（苯乙酸、3-苯丙酸）、酚类（对甲基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚）、脂肪酸类（辛酸、棕榈酸）、烷烃、酰胺（戊内酰胺、芥酸酰胺）、酮类以及一些结构复杂的物质（桔利酮、2,6,10,15-四甲基十七烷等）。

对以上4组GC-MS测试图的物质含量进行分析（表1），当物质含量较低，几乎可以忽略时，用特殊符号※标记。由表1可以看出，对甲基苯酚、苯乙酸、苯丙酸和芥酸酰胺在第1～3天时百分含量降低。原因在于煤发酵产氢初期发生水解作用，通过水解发酵细菌和产氢产乙酸菌等多种厌氧菌分泌胞外酶，催化复杂有机质水解成乙酸、CO2、长链脂肪酸、甘油、NH4+等小分子物质，导致百分含量的降低。在第3～6天时，煤中可利用的小分子化合物较少，大分子化合物开始被微生物分解，百分含量出现大幅增长。但随着液相中的物质不断的被利用，煤中有机质的分解速度降低，所以在第6～9天时百分含量又有所降低。

根据气相色谱仪检测出的结果和标准进行对比得出的小分子挥发性脂肪酸的物质累积量（表2），其中甲酸、乙酸、丙酸均呈现逐渐积累的趋势，而丁酸例外，丁酸在产氢末期部分被利用，导致其含量减少。其中，乙酸的物质累积量最大，为0.29 mmol/L，其次是丁酸、丙酸，甲酸的物质累积量最少。

2.3 实验分析

通过对第1、3、6、9天这4组数据进行总结，并归类进行半定量分析，得出几类主要物质的变化趋势（图4）以及这些物质的变化规律。

2.3.1 饱和烷烃及环烃类

在所有物质中，对比变化最明显的是正构烷烃，在第1～3天，从正二十一烷到正三十三烷百分含量都有所增加，主要原因是水解作用下，煤结构中的烷基侧链被打断。在第3～6天，所有检测到的正构烷烃的含量开始减少，说明正构烷烃已经开始被微生物降解。在第6～9天，正构烷烃的数量又出现增长，或许是微生物分解烷烃的速率小于煤中大分子物质被降解的速率。同时，在第6～9天出现了很多异构烷烃（2,6,11-三甲基十二烷、2,6,10-三甲基十五烷、2,6,10,15-四甲基十七烷、6-丙基十三烷和植烷），这些异构烷烃可能由煤中大分子分解断裂形成。

表1 第1、3、6、9 天测试的物质百分含量对比表

表2 第1、3、6、9天小分子挥发性脂肪酸物质累积量表

图4 产氢过程主要大类物质百分含量变化趋势图

长链脂肪烃及环烃在第1天基本未检出，而后呈现出先增后减再增的趋势，这主要是由于长链饱和脂肪烃及环烃类物质存在于煤的大分子结构和低分子化合物，呈现先增加的趋势是由于在刚开始反应的第1～3天内，煤中小分子物质与大分子之间结合的EDA键中部分活泼的氢键及化学键断裂，小分子中的烷烃类物质溶出，因此含量增加；之后在产氢高峰期被生物酶利用，发生羧化反应进一步生成脂肪酸，因此在第3～6天内含量减少；但随着反应的进行，煤的三维大分子结构部分被木质素分解菌及纤维素菌利用，导致大分子上的桥键及活泼官能团被破坏，因而到产氢末期，烷烃类物质出现增加的趋势。

2.3.2 酸类

液相产物中所检测出来的酸类主要包含小分子挥发性脂肪酸和芳香酸，还有少量的棕榈酸和辛酸。棕榈酸的含量在第3～6天有微弱的减少，原因是棕榈酸会被发酵细菌利用，从而分解成更为简单的产物。辛酸的出现一部分来源于长链脂肪酸的分解，另一部分则来源于煤中大分子链的断开。在产氢过程中，酸的主要来源包含2个部分，一部分来自于煤中低分子化合物，因为低分子化合物本身就含有少量的酸类物质，但这一部分含量较少；另一部分来自于产氢产乙酸菌的产酸阶段，在这一阶段，部分脂肪烃类及芳香烃类物质被产氢产乙酸菌、发酵菌等当作有机碳源加以利用，代谢产物就是脂肪酸及芳香酸类物质。而这些菌属于兼性菌类，体内可同时发生氧化还原2种反应。

芳香小分子酸在产氢过程中发生的增加、减少、再增加、再减少的震荡式变化过程，对应小分子物质释放、微生物利用、烃类氧化及大分子再被降解这一系列生物化学反应过程（图5）。小分子挥发性脂肪酸含量虽少，但却在产氢过程中逐渐积累（图6）。原因在于产氢初期的水解阶段，复杂有机质被分解为乙酸等小分子酸，使其含量增加；随着反应的进行，产氢产乙酸菌开始降解小分子化合物，降解产物主要是乙酸和丁酸，故而乙酸和丁酸的相对含量较高；而在产氢末期，丁酸被消耗，可能的原因是丁酸被分解为乙酸或丙酸，这和乙酸、丙酸的累积量升高有关。同时，脂类、醛类、酮类物质含量的减少，也是造成小分子脂肪酸含量升高的原因。

2.3.3 多肽及氨基酸类物质

图5 芳香酸类物质百分含量变化情况图

图6 小分子挥发性脂肪酸类物质累积量变化情况图

氨基酸类物质最早来自于成煤植物过程中的蛋白质类物质，如戊内酰胺。在成煤过程中，蛋白质是比较容易被分解的活泼有机物，在泥炭化作用的早期氧化阶段，蛋白质在各种蛋白酶的作用下分解为NH3、CO2等气体而逸散，当未完全分解的蛋白质进入还原层以后，就会被保留下来继而转化为煤的组成部分。在产氢过程中，氨基酸类物质变化情况是在第1～3天先减少，而后在第3～6天再增加，产氢末期又减少（图7）。其原因在于，蛋白质类物质活泼且易被利用，因此在产氢初期就能被许多兼性菌摄取，所以物质含量先减少；而随着反应的进行，在产酸阶段时，更多的酰胺键断裂生成氨基酸等物质，导致其含量增加；最后由于厌氧氨氧化菌的作用促使其进一步分解导致物质含量减少。

图7 氨基酸类物质百分含量变化情况图

2.3.4 脂类化合物

大部分脂类化合物在成煤过程中能够完整地保存下来，甚至在显微镜下也能够明显观察，但在液相代谢产物中无法检测出。而本实验检测出的甘油和甘油酯属于脂类化合物中较容易被利用的成分，其变化情况如图8所示。在产氢初期所检测出的甘油及甘油酯含量很低，近乎为0；产氢高峰期，煤中的大分子结构开始分解产生甘油和甘油酯，导致百分含量不断升高；在产氢末期，在发酵细菌的作用下，甘油和甘油酯被利用产生酸类物质，其百分含量降低。

图8 脂类化合物百分含量变化情况图

2.3.5 少量醛、酮类物质

在烃类物质的不完全氧化反应中，有部分物质转化成了中间过程产物醛类及酮类物质，而最终转化为酸。产氢过程属于产甲烷的前提阶段，其最终代谢产物主要是小分子酸类物质，因而在产氢阶段结束后反应液的pH值会明显下降，而此时的酸类物质也为后续乙酸发酵产甲烷过程提供了有效利用体。

3 结论

1）褐煤厌氧发酵过程中液相产物的变化规律和气相产物氢气的变化相对应。在产氢初期，产氢菌无法直接利用大分子物质，所以产氢量较少，在发酵菌、水解菌等微生物的作用下，煤中复杂有机质被转化为相对简单的烷烃类、小分子挥发性脂肪酸等物质；在产氢高峰期，氢气的产生和酸类物质有直接的关系，在生物酶的催化作用下直链烷烃发生羧化反应进一步生成脂肪酸，导致烷烃减少，酸类物质增加，从而使产氢量到达一定的峰值；在产氢末期，在产酸菌的进一步作用下，降解反应继续进行，挥发性脂肪酸含量增加较多，导致培养环境pH值过酸化，产氢菌活性降低，产氢速率受到抑制，氢气的产量下降。

2）小分子挥发性脂肪酸在产氢过程中逐渐积累，芳香小分子酸在产氢过程中发生的增加、减少、再增加、再减少的震荡式变化过程，分别对应小分子物质释放、微生物利用、烃类氧化及大分子再被降解这一系列生物化学反应过程。液相产物中检测出的脂类、醛类、酮类物质是产酸的母源物质，其变化量与酸类增长具有一定关联。

3）通过对褐煤厌氧发酵产氢液相中间产物及相互转化规律的研究，不仅有助于对发酵过程中液相中间产物进行全方面的了解，而且还揭示了产氢过程气—液两相之间相互对应的生物化学效应，同时对深化煤发酵产氢机理具有长久而深远的意义。