构象可控DNA-金纳米粒子复合材料的制备与表征

2019-08-30曹行行

安徽化工 2019年4期

王棒，曹行行

（合肥工业大学化学与化工学院，安徽合肥230009）

金纳米粒子具有良好的稳定性[1]和生物相容性[2]以及特殊的纳米尺寸效应[3]，一直以来都是研究和应用的热点。DNA 纳米技术[4]提供了一种自下而上（bottom-up）程序化构建纳米材料的新方法。DNA 功能化金纳米粒子（AuNP）不仅具有AuNP 的光学和物理化学特性，而且拥有可编程组装能力以及生物相容等性质。目前，DNA-AuNP 复合材料已经被广泛应用于生物传感[5]、胶体晶体组装[6-7]、生物成像[8]等领域，但是大部分报道中的组装方法比较复杂且产物产率不高，对组装机制的探索仍然较少。为此需要努力探索更直接的组装方法和更明确的组装机制。

本文基于DNA 纳米技术，实现巯基DNA（Y1-thiol）和金纳米粒子的连接，并利用琼脂糖凝胶电泳（AGE）成功提取“单价态”产物，然后与DNA 模块中另外两条单链退火组装，即可介导金纳米粒子形成特定的离散结构。通过改变模块翻转角度等因素制备了正四面体、正八面体构象可控的金纳米粒子寡聚结构。透射电子显微镜（TEM）照片证实金纳米粒子寡聚结构的存在。结果表明，13 nm 的金纳米粒子的四聚体产率可达60.02%。

1 实验部分

1.1 仪器和药品

DYY-6C 型电泳仪；调温万用电炉；24 DN 制胶器；场发射透射电子显微镜（TEM）。

琼脂糖（Agarose B），氯化钠（NaCl），氯金酸（HAuCl4），三（2-羧乙基）膦（TCEP），醋酸镁（（CH3COO）2Mg·4H2O），尿素（Urea）等。

1.2 实验方法

（1）DNA 序列及组装模块示意图（图1）

图1 DNA 序列及组装模块示意图

（2）DNA 修饰金纳米粒子

先用变性凝胶对相关3-arm tile DNA 进行纯化，之后在紫外260 nm 处定量DNA 浓度。取适量的Y1-thiol链与TCEP 在0.5×TBE 缓冲液中混合作用30 min 左右，TCEP 与DNA 的摩尔计算比应大于200。将DNA 溶液与一定量的金纳米溶液相混合（通常DNA∶Au5NPs=1∶1，DNA∶Au13NPs=2∶1），缓冲体系是0.5×TBE。

（3）单价态DNA-AuNPs 的提取

将上一步得到的DNA-AuNPs 产物，在琼脂糖凝胶中进行电泳。首先在胶中切取“一价态”条带，接着利用电洗脱技术，提取出“单价态”产物，即金纳米表面只连接了一条Y1-thiol 链。运用逐渐加盐老化的方法，添加1.0 M NaCl 使混合液中NaCl 浓度依次达到50 mM、100 mM、200 mM、300 mM、500 mM，间隔时间2～3 h。

（4）慢速退火组装

根据紫外光下最大吸收波长520 nm 处的吸收峰值，按照朗伯-比尔定律计算出“AuNPs-Y1-thiol”的浓度。在1×TAE/Mg2+缓冲液中，添加3-arm tile 的其余两条链，按照一定的模块浓度（4.0 turn-100 nM，4.5 turn-50 nM），进行60℃～4℃慢速退火组装。

（5）浓缩提取样品

使用超滤管在2 000 rpm 的转速下离心5～7 h 处理样品；在琼脂糖凝胶中将组装产物与Y1-AuNPs 进行速率对比，切取目标产物条带，进行电洗脱操作。所有操作在4℃环境下进行，确保产物稳定不破碎。

1.3 TEM 表征

对于电洗脱得到的产物，取5 μL 滴在铜网上静置10 min，放置在空气中自然晾干转移至样品盒里；利用TEM表征金纳米粒子的组装情况。

2 结果与讨论

图2 是5 nm AuNP-DNA 复合物的琼脂糖凝胶电泳分离胶图。泳道1 是裸金（没有加入巯基链Y1SH），泳道2～5 分别为加入不同Y1SH 修饰得到的AuNP-DNA 复合物。根据胶图结果可得知，分离得到了5 个不同DNA价态的AuNP-DNA 复合物，根据电泳速率由快至慢（凝胶中顺序为自下而上）依次为 AuNP-DNA1、AuNP-DNA2、AuNP-DNA3、AuNP-DNA4、AuNP-DNA5。其中，AuNP-DNA1、AuNP-DNA2、AuNP-DNA3 三种价态产物在图2 中已经利用图形标记出。切取AuNP-DNA1 电泳条带，装入透析袋中进行电洗脱纯化处理。对于AuNP-DNA1 而言，单条DNA 修饰的金纳米粒子复合物不能承受较高的盐浓度，因此，采用室温条件下逐渐加盐老化修饰短链DNA 的方法，增强其稳定性。首先，根据吸收光谱测定了AuNP-DNA1 的浓度，然后加入合适比例T5-thiol 短链以保证金纳米不会在高浓度盐溶液中团聚，对于AuNPs 来说，T5-thiol 均为过量。其中对于Au5NPs 来说，T5-thiol 的摩尔浓度为金纳米粒子的100 倍；对Au13NPs 来说，T5-thiol 的摩尔浓度为金纳米粒子的300 倍。加盐老化之后，再次根据吸收光谱定量AuNP-DNA1 的浓度。

图2 5 nm AuNP-DNA 复合物的琼脂糖凝胶电泳分离胶图

4Au5NP@TET 的琼脂糖胶图表征如图3（a）所示。其中，4 Au5NP 表示为5 nm 金纳米粒子四聚体，@TET 表示为四面体构象。图3（a）中，泳道1 是Au5NP-DNA1 样品，作为对照，泳道2 是4Au5NP@TE 退火组装样品，泳道3 是4Au5NP@TET 溶液样品经过超滤离心得到的浓缩样品。通过对比泳道1 与泳道2、3 的电泳速率，发现泳道2、3 中样品电泳速率明显慢于泳道1 中样品，因此，可以初步判断泳道2、3 中样品为金纳米粒子寡聚组装体。通过对比泳道2 与泳道3 中样品电泳速率，发现超滤离心浓缩处理对金纳米粒子组装样品的破坏作用很小，进而排除了浓缩操作对组装样品的影响。

图3（b）是4Au5NP@TET 目标产物的TEM图。根据TEM结果可以看出，主要的产物为金纳米粒子四聚体。在TEM图片上没有发现金纳米粒子的较大聚集体。这与DNA 辅助金纳米粒子“根据DNA 三分支模块的组装路径”形成四面体构象结构的设计思路相符。透射电镜的表征结果充分证实了组装思路是正确可行的。

图3 4Au5NP@TET 产物的琼脂糖胶图表征（a）及TEM 表征（b）

采用相同的Au5NP-DNA1 样品（即相同的DNA 中心链Y1SH），加入另外一组DNA 短链，可以得到不同构象的金纳米粒子寡聚结构。加入两条链（M2、S3）能够与金纳米粒子表面的DNA 链Y1SH 形成立方体结构，所得金纳米粒子寡聚结构为正八面体构象。组装过程如前，琼脂糖凝胶电泳表征结果如图4（a）所示。该类组装产物标记为8Au5NP@Cube。其中，8Au5NP 表示为5 nm金纳米粒子八聚体，@Cube 表示为正八面体构象。图4（a）中，泳道1 是Au5NP-DNA1 样品，泳道2 是4Au5NP@TET 退火组装样品，泳道3 是8Au5NP@Cube组装样品。观察泳道2 和3，利用M2、S3 短链组合制备得到了更大的金纳米粒子寡聚结构。切取泳道3 中的“目标”条带，然后在1×TAE/Mg2+缓冲液中进行电洗脱操作，用移液枪依次取5 μL 样品至铜网，静置10 min，再采用透射电子显微镜进行表征。图4（b）是8Au5NP@Cube 产物的透射电子显微图。TEM结果表明，在DNA 链（M2、S3）辅助下，金纳米粒子可以组装得到八聚体。这一点也证实了实验的设计，利用DNA 相互连接，便可得到正八面体构象的金纳米粒子寡聚结构。

图4 8Au5NP@Cube 产物的琼脂糖胶图表征（a）及TEM 表征（b）

我们进一步构筑了具有四面体构象的Au13NP 寡聚组装结构。琼脂糖凝胶电泳表征结果如图5（a）所示。为方便区分，该类组装产物分别标记为4Au13NP@TET（4bp）、4Au13NP@TET（6bp），其中，4 Au13NP 表示为13 nm 金纳米粒子四聚体，@TET 表示为四面体构象，（4bp）（6bp）表示模块粘性末端长度为4、6 个碱基对。图4（a）中，泳道1 是Au13NP-DNA1，泳道2 是4Au13NP@TET（4bp），泳道3 是4Au13NP@TET（4bp）离心浓缩样品，泳道4 是4Au13NP@TET（6bp），泳道5 是4Au13NP@TET（6bp）离心浓缩样品。通过对比泳道1 与2～5 中条带电泳速率，认为泳道2、3 中主要形成三个不同组装产物条带，根据电泳速率从快到慢，分析认为可能为Au13NP二聚体、三聚体、四聚体。泳道4、5 中，三种组装产物中的二聚体比例最高。分析认为，由于TET（6 bp）相较TET（4 bp），其粘性末端碱基配对数目增加，使得模块间相互作用增强，因此，容易导致形成较小的聚集结构，即二聚体。此外，相比于4Au5NP@TET，4Au13NP@TET（4bp）组装过程中出现了二聚、三聚的现象，分析认为可能由于金纳米粒子粒径增大，导致粒子间的空间位阻增大。图5（b～d）是三种组装体的TEM表征结果。透射电子显微图表明，电泳速率从快到慢的三个条带产物依次为Au13NP 二聚体、三聚体与四聚体。根据TEM表征结果对4Au13NP@TET（4bp）四聚体产物（图5（d）样品）做统计分析：统计了748 个Au13NP 组装体，其中四聚体有450 个，产率达到了60.02%。