黄鳍棘鲷微卫星标记开发及其在鲷科鱼类中的跨物种扩增

吴仁协，翟 云，肖 瑶，牛素芳，张浩冉，黎 晓，陈伟勇

（广东海洋大学水产学院，广东 湛江524088）

黄鳍棘鲷（Acanthopagrus latus）隶属于鲈形目、鲷科、棘鲷属（Acanthopagrus），是广泛分布于印度—西太平洋近海的暖水性中下层经济鱼类［1］。在我国，黄鳍棘鲷主要分布于东南沿海，其肉质鲜美、经济价值高，已成为我国海水鱼类的重要养殖对象［2］。自上世纪90年代以来，由于过度捕捞、近海环境恶化以及近亲繁殖等原因，黄鳍棘鲷自然资源严重衰退，其种质资源出现明显退化［3-4］。为了恢复与保护黄鳍棘鲷种质资源，各国政府实施了一系列渔业管理措施。比如澳大利亚政府削减渔业资格捞捕证的颁布数量，以期控制黄鳍棘鲷的资源捕捞量［5］；日本政府在重要沿海口岸实施黄鳍棘鲷苗种增殖放流；在我国东南沿海常年大量放流黄鳍棘鲷鱼苗［6］。目前，有关黄鳍棘鲷的生物学、养殖技术、人工育苗等方面已有广泛的研究报道［7-8］。但是，关于黄鳍棘鲷种群遗传多样性和遗传结构的研究报道较少［4］，这与缺乏大批量的高多态性分子标记有关，难以对其种质资源现状做出精确的遗传学评估。

微卫星序列（Microsatellites DNA）是由中间高度变异的核心序列和两旁相对保守的侧翼序列组成，广泛存在于各类真核生物基因组中，分布均匀且高多态性、呈孟德尔共显性遗传特性，具有检测快速、操作简单等优点，已成为生物种质资源研究最为常用的第二代分子标记［9-10］。关于黄鳍棘鲷的微卫星标记，已有学者采用传统的富集文库法共开发了24个二碱基重复的微卫星标记［11-13］，并显示出较高的多态性。然而，二碱基重复微卫星位点在PCR扩增中容易因“滑动链错配”产生影子带而导致分型结果错误［14］。此外，传统的微卫星标记开发方法比如富集文库法、基因组DNA文库筛选法等，存在开发过程繁杂、成本高昂、效率较低等缺点，通常一次只能筛选几个或十几个可用位点［15］。因此，有必要借助高通量测序平台来识别和筛选出大批量、多碱基重复的黄鳍棘鲷微卫星位点，以促进其种群遗传背景调查、种质资源评估和分子标记辅助育种等相关研究。

SLAF-seq（Specific-Locus Amplified Fragment sequencing）是一种通过酶切、构建SLAF文库和高通量测序来快速获取样品基因组DNA中SLAF标签序列的简化基因组测序技术［16］。SLAF-seq技术具有实验成本低、开发周期短、获取标记数量和类型丰富等优点，是一种高效且经济的分子标记开发方法，已成功应用于多种鱼类的微卫星标记开发［17-20］。鉴于此，本研究采用SLAF-seq技术来筛选黄鳍棘鲷基因组DNA中高多态性的微卫星位点，以期为该物种的种质资源评估提供新的有效分子标记。同时，将所开发的微卫星标记在9种鲷科鱼类中进行跨物种扩增，以检测开发标记在近缘种中的通用性。

1 材料与方法

1.1 样品采集和基因组DNA提取

2014年7月，采集广东雷州珍稀海洋生物国家级自然保护区（简称雷州保护区，下同）和阳西县近岸的32尾野生黄鳍棘鲷用于本研究。经形态学鉴定后，取鱼体背部肌肉，先后在体积分数为75%、85%和95%的酒精中进行脱水处理，于-20℃冰箱保存。样品基因组DNA提取采用蛋白酶-苯酚氯仿法［21］。

1.2 SLAF-seq测序和微卫星引物合成

由北京百迈客生物科技有限公司进行1个样品肌肉样的高通量测序，采用SLAF-seq技术来筛选黄鳍棘鲷全基因组范围内的微卫星位点。基因组酶切、文库构建和高通量测序参见张浩冉等（2018）［18］的研究。采用微卫星识别软件MISA（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html/）对所得的微卫星位点进行搜集与统计，并挑选151个二至六碱基的微卫星位点进行引物合成。

1.3 微卫星引物筛选、三引物PCR扩增和分型检测

本研究的151个微卫星位点引物多态性筛选方法参照张浩冉等的研究［18］。初步筛选出可产生2条及以上特异性等位基因条带的位点即为多态性位点。根据Schuelke（2000）报道的M13标记法［22］，对筛选出的64个黄鳍棘鲷多态性微卫星位点的正向引物5′端添加M13序列，并合成标记为FAM或HEX荧光基团的M13通用引物，引物修饰和合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。通过梯度PCR（52～62℃）重新摸索三引物（修饰的正、反向引物和M13通用引物）PCR扩增的最适退火温度（表1）。三引物PCR反应体系和扩增产物检测参照翟云等（2018）的研究［17］，由武汉天一辉远生物科技有限公司进行PCR扩增产物的等位基因分型检测。

1.4 跨物种扩增

采用9种鲷科鱼类进行黄鳍棘鲷微卫星标记的跨物种扩增检测，包括太平洋棘鲷（Acanthopagrus pacificus，4尾，湛江硇洲岛近岸）、黑棘鲷（Acanthopagrus schlegelii，6尾，湛江硇洲岛和雷州保护区近岸）、澳洲棘鲷（Acanthopagrus australis，2尾，湛江硇洲岛近岸）、台湾棘鲷（Acanthopagrus taiwanensis，1尾，台湾岛西岸）、平鲷（Rhabdosargus sarba，6尾，湛江硇洲岛和雷州保护区近岸）、二长棘梨齿鲷（Evynnis cardinalis，7尾，湛江硇洲岛和雷州保护区近岸）、真赤鲷（Pagrus major，6尾，湛江硇洲岛近岸）、蓝点赤鲷（Pagrus caeruleostictus，2尾，北海近岸）和黄牙鲷（Dentex hypselosomus，5尾，湛江硇洲岛近岸）。PCR扩增体系和扩增产物检测同“1.3”。扩增结果出现1条或1条以上的特异性等位基因条带的微卫星标记即为具有通用性位点。

1.5 数据分析

微卫星位点的等位基因数（Na）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、多态信息含量（PIC）等基本遗传参数由Cervus 3.0.7软件计算［23］，各位点的哈迪-温伯格平衡（HWE）及连锁不平衡由GenePop 4.3软件检测［24］。通过Micro-Checker 2.2.3软件在Brookfeld-1算法下估算位点的无效等位基因频率（Fua）［25］，使用FSTAT 2.9.3软件分析位点的近交系数（Fis）。

2 结果与讨论

2.1 SLAF-seq测序

采用SLAF-seq技术，通过简化基因组深度水平测序，共产生2.32 M reads读长，其中测序质量值（Q）大于等于30的读长占总数的75.63%，表明大部分碱基测序出错的概率低于0.10%。将酶切片段长度在415～514 bp的序列定义为SLAF标签，平均测序深度为9.13×。过滤质量较差的测序数据后，共获得137 358个SLAF标签。

利用MISA共搜索出30 676个微卫星位点，其中最多的为单碱基重复，有14 018个（占总位点的45.70%，下同）；其次是二碱基重复，有12 302个（40.10%）；三碱基重复和四碱基重复也有相当数量，分别有2 833个（9.24%）和1 265个（4.12%）；五碱基重复和六碱基重复数量则较少，分别仅有222个（0.72%）和36个（0.12%）。

2.2 多态性微卫星标记筛选和遗传多样性参数

经PCR扩增检测后，在151个二至六碱基重复微卫星位点中有64个显示出多态性，其多态比率为42.38%。这些多态性引物经荧光标记修饰后，最终有47对引物在32个黄鳍棘鲷基因组DNA中扩增出具有特异性且清晰的等位基因条带（表1），包括17个二碱基、6个三碱基、8个四碱基、10个五碱基和6个六碱基重复位点，引物序列的GenBank登录号为MG214909～MG214955。

47个微卫星位点扩增片段大小为102～374 bp，共检测出464个等位基因，等位基因数在2（AL6-9）和27（AL2-9）之间（均值为10）。Ho在0.156（AL6-9）和0.938（AL4-11）之间（均值为0.628），He在0.177（AL3-7）和0.963（AL2-9）之间（均值为0.741）。47个位点的PIC平均值为0.705，有44个位点的PIC值均大于0.250，仅3个位点（AL3-7、AL3-11、AL6-9）的PIC值小于0.250，表明大多数位点显示出较高的多态性。经Bonferroni校正后（校正p＜0.001 1），有4个位点（AL2-16、AL4-12、AL5-1、AL5-9）偏离HWE并显示较高的Fis值（分别为0.415、0.455、0.509、0.293）和Fua值（分别为0.163、0.212、0.221、0.128）；其余43个位点均符合HWE检验，且各位点之间不存在连锁不平衡。

2.3 微卫星标记跨物种扩增检测

有31个黄鳍棘鲷微卫星标记可在1种或1种以上鲷科鱼类中有效扩增出特异性条带（表2）。其中AL2-1、AL2-8、AL3-1、AL4-1分别可在9、8、7、6种鲷科鱼类中扩增，AL2-4、AL2-9、AL2-17、AL6-7等4个位点可在4个物种中扩增，AL2-2、AL2-11、AL2-12、AL2-14、AL3-7、AL3-9、AL4-5、AL4-11、AL4-12、AL5-3、AL6-3、AL6-6等12个位点可在3个物种中扩增，AL2-5、AL3-11、AL4-2、AL4-4、AL6-2等5个位点可在2个物种中扩增，AL2-13、AL2-19、AL4-8、AL5-6、AL5-8、AL6-1等6个位点只在1个物种中扩增。

从表2可以看出，31个黄鳍棘鲷微卫星标记在太平洋棘鲷、黑棘鲷和澳洲棘鲷中的扩增成功率较高，分别为63.8%（26个位点）、51.1%（24个位点）和48.9%（23个位点）；在平鲷、二长棘梨齿鲷、真赤鲷、蓝点赤鲷和黄牙鲷的扩增成功率相对较低，在前两者中分别为14.9%（7个位点）和10.6%（5个位点），在后三者中均为8.5%（均为4个位点）；意外的是在台湾棘鲷中的扩增成功率最低，仅为2.1%（1个位点）。在标记通用性方面，有17个黄鳍棘鲷微卫星标记（AL2-1、AL2-8、AL2-9、AL2-11、AL2-12、AL2-14、AL2-17、AL3-1、AL3-7、AL3-9、AL4-1、AL4-5、AL4-11、AL5-3、AL6-3、AL6-6、AL6-7）在太平洋棘鲷、黑棘鲷和澳洲棘鲷中均可扩增，而只有3个标记（AL2-1、AL2-8、AL3-1）可在二长棘梨齿鲷、真赤鲷、蓝点赤鲷及黄牙鲷中扩增。

表1 黄鳍棘鲷47个多态性微卫星标记信息及其遗传参数Tab.1 Information and genetic indices of 47 polymorphic microsatellite markers of Acanthopagrus latus

续表1

续表1

表2 黄鳍棘鲷31个微卫星标记在9种鲷科近缘种中的跨物种扩增Tab.2 Cross-species amplifications of the 31 microsatellite markers of Acanthopagrus latus in 9 relative species of family Sparidae

续表2

2.4 讨论

2.4.1 SLAF-seq技术开发微卫星标记的优势 Xia等 （2006）、夏军红等（2007）、Ahmad-Syazni等（2012）采用磁珠富集法构建黄鳍棘鲷基因组微卫星富集文库分别获得了58、41、33个二碱基重复的微卫星序列，而后分别只开发出11、3、10个多态性微卫星标记［11-13］。本研究基于SLAF-seq技术识别出黄鳍棘鲷16 658个二至六碱基重复微卫星位点，在挑选的151个位点中成功开发出47个多态性微卫星标记，其位点识别数量和开发效率比以往的研究报道提高了上百倍。此外，本研究的微卫星位点还包含了采用传统开发方法难以获取的大量多碱基重复位点（四至六碱基重复有1 523个），有效保障了标记开发的数量要求和标记类型的多样化。可见，基于SLAF-seq技术开发物种微卫星标记具有明显的优势和便利，非常适用于大规模的分子标记开发［18-19］。同时，本研究开发的30个高多态性三至六碱基重复微卫星标记完全不同于已报道的24个黄鳍棘鲷二碱基重复微卫星标记［11-13］，尤其是24个多碱基重复（四至六碱基）的微卫星标记在等位基因分型中通常比二碱基重复位点具有更高的准确性和有效性［9］，可为黄鳍棘鲷种质资源评估提供新的分子标记和分析角度。

2.4.2 黄鳍棘鲷微卫星标记的多态性和HWE偏离 本研究的微卫星位点的Na均值（10）、Ho均值（0.682）和He均值（0.742）均低于Xia等［11］和Ahmad-Syazni等［13］所报道的黄鳍棘鲷二碱基重复微卫星位点的Na均值（分别为17.1、18.1，下同）、Ho均值（0.74、0.867）和He均值（0.91、0.92）。这可能与本研究含有较多的四至六碱基重复位点（占总位点的51.06%），而之前所开发的二碱基重复位点通常比多碱基重复位点具有更高的遗传变异有关［26］。然而，本研究的Ho均值不但高于Dewoody等（2000）统计的32种鱼类微卫星标记的Ho均值（0.63）［27］，也稍高于花鲈（Lateolabrax maculatus）、带鱼（Trichiurus japonicus）和沙带鱼（Lepturacanthus savala）微卫星标记的Ho均值（分别为0.674、0.620、0.634）［10，18-19］，表明所开发的47个黄鳍棘鲷微卫星标记具有较高的多态性和遗传变异水平。PIC可反映遗传标记的多态性程度，当PIC≥0.500时，该位点为高度多态位点；当0.250≤PIC＜0.500时，为中度多态位点；当PIC＜0.250时，则为低度多态位点［28］。本研究的47个微卫星标记PIC平均值为0.705，有41个位点呈高度多态性，且各位点间不存在连锁不平衡。表明所开发的大部分微卫星标记含有丰富的遗传变异信息，在黄鳍棘鲷种群遗传资源研究中具有较高的潜在应用价值。

经过Bonferroni校正后，本研究有4个位点（AL2-16、AL4-12、AL5-1、AL5-9）偏离HWE，显示出杂合子缺失现象。同时这4个位点均具有较高的Fis（0.293～0.415）和Fua（0.128～0.221），提示近亲交配和无效等位基因可能是造成这4个位点偏离HWE的重要原因。此外，随着人工繁殖技术不断成熟和完善，中国沿海黄鳍棘鲷的养殖面积和养殖规模不断扩大，增加了养殖群体的逃逸机会，同时近年来各沿海先后开展了大规模的增殖放流活动，这些人为因素加剧了黄鳍棘鲷种群的生态遗传风险，可能导致养殖群体与野生群体的种质混杂和降低种群遗传多样性［7］。因此，种群退化和自然选择导致本研究4个微卫星位点偏离HWE的可能性还难以排除［29］，有待于今后进一步研究确认。

2.4.3 黄鳍棘鲷微卫星标记在鲷科鱼类中的通用性 本研究的黄鳍棘鲷微卫星标记在同属的太平洋棘鲷、黑棘鲷和澳洲棘鲷中的跨物种扩增成功率较高（48.9%～63.8%），其次是在平鲷中（14.9%），而在二长棘梨齿鲷、真赤鲷、蓝点赤鲷及黄牙鲷中的成功率较低（8.5%～10.6%），表明跨物种扩增成功率与物种间遗传距离有直接的相关性［30］。基于线粒体COI基因序列的系统进化关系研究表明中国鲷科鱼类可分为两大类群，类群I包括四长棘鲷属（Argyrops）、犁齿鲷属（Evynnis）、赤鲷属（Pagrus）、牙鲷属（Dentex）等红体色种类，类群Ⅱ含平鲷属（Rhabdosargus）、棘鲷属等银灰体色种类［31］。可见，除了棘鲷属外，黄鳍棘鲷与平鲷属的亲缘关系更近于它与其他鲷科鱼类。这种系统进化关系与本研究的跨物种扩增结果相对应。同时，本研究的跨物种扩增结果也从核基因方面进一步支持了中国鲷科鱼类属间的系统划分［31］。值得注意的是，黄鳍棘鲷微卫星标记在台湾棘鲷中的跨物种扩增成功率（2.1%）远低于棘鲷属和其他鲷科鱼类，仅有1个位点具有通用性。这可能与台湾棘鲷可检测样品数量少（仅1尾）且基因组DNA质量不佳有关，难以扩增出清晰的微卫星条带，导致实验结果出现误差。

除台湾棘鲷外，本研究的跨物种扩增成功率（平均值为26.85%）低于带鱼和沙带鱼的微卫星标记在6种带鱼科鱼类中的跨物种扩增成功率（平均值分别为33.86%和41.43%）［18-19］，但大于花鲈在10种尖吻鲈科和鮨科鱼类中的跨物种扩增成功率（3.8%～15.4%）［10］，这可能与研究所检测的种类数量有关，也可能与不同科的属、种间的遗传分化程度有关。此外，本研究有17个标记在棘鲷属（除台湾棘鲷）中能有效扩增，说明这些标记具有较好的通用性，可以适用于该属鱼类的系统进化和种群遗传学分析。但只有3个标记可在二长棘梨齿鲷、真赤鲷、蓝点赤鲷及黄牙鲷中有效扩增，难以满足后续种质资源评估对分子标记数量的要求。

3 结论

基于SLAF-seq技术，本研究在识别出大量微卫星位点的基础上，成功开发出47个二至六碱基重复的多态性黄鳍棘鲷微卫星标记，为该物种的种质资源评估和种群遗传分析提供了新的有效分子标记。本研究的开发方法为其他鱼类的微卫星标记筛选提供了可靠的方法参考和经验借鉴。同时，17个开发标记在棘鲷属中具有较好的通用性，可为该属鱼类的分子系统进化研究提供新的标记来源和研究角度。