单孔孔板水力空化对大豆球蛋白理化性质的影响

王 芳，杨 锋，任仙娥*，黄永春，黄承都，刘纯友，张昆明，阎柳娟

（广西科技大学生物与化学工程学院，广西糖资源绿色加工重点实验室，广西高校糖资源加工重点实验室，广西 柳州 545006）

空化技术是一项食品物理加工新技术。近年来，超声空化已在食品蛋白质改性方面得到了国内外很多学者的关注和研究，如Jambrak[1]、Hu Hao[2]、涂宗财[3]等的研究结果表明超声波产生的空化效应能使大豆蛋白的结构变得松散，分子间作用力减弱，平均粒径减小，表面疏水性增加，二级结构发生改变，溶解性、乳化性增加，凝胶性等功能性质得到改善。然而，超声空化因能量利用率较低、空化效应区域小等弊端，使得其应用规模受到限制。与超声空化产生方法不同的水力空化由于所形成的空泡与液体一起做整体运动，可在较大范围内形成比较均匀的空化场，加上能量利用率高，使得其更具工业化应用优势[4]。水力空化是液体流经孔板、文丘里管、叶轮或转子等时引起较大压力波动产生的，其空化泡溃灭瞬间产生与超声类似的空化效应，如剪切力、冲击波、极端高温和高压、自由基等[5]。其中，由孔板产生水力空化具有空化场分布范围广、强度均匀、易实现等优点，近年来在废水处理[6]、有机废物的降解[7]、微生物细胞的破碎[8]和生物柴油的制备[9]等领域都有研究。

目前已有相关研究将基于涡流的水力空化用于米渣蛋白和大豆分离蛋白的改性，发现涡流空化在一定条件下能改善米渣蛋白和大豆分离蛋白的溶解性、乳化性和起泡性[10-12]，但是关于孔板水力空化在蛋白质改性方面还鲜见报道，因此本实验利用单孔孔板水力空化技术处理大豆球蛋白，研究单孔孔板水力空化对大豆球蛋白理化性质的影响及作用机理，为将孔板水力空化技术应用到蛋白质的物理改性领域提供一定的理论依据及实践探索。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂豆粕 大海粮油工业（防城港）有限公司。

十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、1-苯胺-8-萘磺酸（1-anilino-8-naphthalenesulfonic acid，ANS）、对苯二甲酸、5,5'二硫代双(2-硝基苯甲酸)（5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）、丙烯酰胺、过硫酸铵、β-巯基乙醇、考马斯亮蓝R250 上海阿拉丁试剂有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；RF-5301PC型荧光分光光度计 日本岛津公司；Avanti J-26 XPI高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；Nano ZS90纳米粒度仪、Zeta电位分析仪 英国马尔文仪器有限公司；电泳系统 美国伯乐公司；JYD-650智能型超声波细胞粉碎机 上海之信仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 单孔孔板水力空化与超声空化的空化产额比较

单孔孔板水力空化装置示意图如图1所示，由贮罐、阀门、离心泵（功率550 W）、压力表、孔板（孔直径3 mm、厚度20 mm）、管路（直径18 mm）组成。当流体流经孔板时，流速增大，压力降低，当压力低于该流体的饱和蒸汽压时，流体汽化同时溶解在流体中的气体释放出来产生大量空化泡，当空化泡随流体流到下游压力恢复区时，空化泡溃灭，从而产生空化效应。为评价单孔孔板水力空化的空化效应，本研究采用对苯二甲酸荧光法测定该实验装置的空化产额，并与采用超声空化处理的空化产额相比较[13]。配制2 mmol/L对苯二甲酸溶液，取700 mL进行超声波处理（功率550 W），同时取700 mL进行单孔孔板水力空化处理（30 min），测定其在激发波长310 nm，发射波长425.6 nm，狭缝宽均为5 nm条件下的荧光强度，计算单孔孔板在水力空化和超声空化下的空化产额。

图1 单孔孔板水力空化装置示意图Fig. 1 Schematic diagram of hydrodynamic cavitation in single hole orifice plate

1.3.2 大豆球蛋白的制备

参照Nagano等[14]的方法，将粉碎后的脱脂豆粕过80 目筛，按料液比1∶15（m/V）加入蒸馏水，然后用2 mol/L NaOH调节至pH 8.0，恒温磁力搅拌1 h后在4 ℃、9 000×g下离心10 min，得上清液。再向上清液中加入0.01 mol/L NaHSO3，搅拌均匀后用2 mol/L HCl调节至pH 6.4，放入冰箱（4 ℃）中冷藏过夜，然后在4 ℃、6 500×g下离心10 min，沉淀即为大豆球蛋白。将沉淀透析脱盐，再用2 mol/L NaOH调节至pH 7.5，冷冻干燥备用。

1.3.3 单孔孔板水力空化处理大豆球蛋白

将大豆球蛋白配成质量分数为3%的分散液，取700 mL倒入单孔孔板水力空化装置的贮罐中，启动装置，开启冷凝水使大豆球蛋白在整个处理过程中温度不超过35 ℃，处理不同时间（5、10、20、30 min）后取样测定其理化指标。

1.3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

配制质量分数为13%的分离胶和质量分数为4%的浓缩胶。将蛋白质样品稀释至3 mg/mL，取40 μL稀释后的蛋白液与80 μL样品缓冲液（非还原样品缓冲液不加β-巯基乙醇）混合均匀后于95 ℃下加热5 min，冷却后上样，上样量为10 μL。进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）时蛋白质样品在浓缩胶中电流为16 mA，进入分离胶后将电流调为28 mA。SDS-PAGE结束后，先对其进行固定，然后采用考马斯亮蓝R250染色，再进行脱色，直至出现清晰的蛋白条带为止，最后使用凝胶成像系统进行成像处理。

1.3.5 粒径和Zeta电位的测定

将蛋白质样品稀释至3 mg/mL，于室温下采用纳米粒度仪测定各样品的粒径。再取样品测定其Zeta电位，测定条件如下：1 cm聚苯乙烯池，一对0.45 cm2铂电极，间距为0.4 cm，测定温度为25 ℃，平衡时间为2 min。

1.3.6 内源荧光光谱的测定

参照Jiang Lianzhou等[15]的方法，将蛋白质样品稀释至0.6 mg/mL，采用荧光分光光度计测定，设置激发波长为290 nm，扫描发射波长范围为300～400 nm，激发和发射狭缝宽度均为3 nm。

1.3.7 表面疏水性的测定

参照Haskard等[16]的方法，以ANS为荧光探针，将蛋白样品用0.2 mol/L、pH 8.0的磷酸盐缓冲液稀释至不同质量浓度（0.005～0.5 mg/mL），取样品4 mL，加入10 μL 8 mmol/L ANS溶液，混合均匀后，在荧光分光光度计下进行测定，设定激发波长为370 nm，发射波长470 nm，狭缝宽为5 nm。以荧光强度对蛋白质量浓度作图并进行线性回归，以线性回归斜率作为蛋白质的表面疏水性。

1.3.8 巯基含量的测定

参考Hu Hao等[17]的方法，将蛋白样品稀释至10 mg/mL，取2 mL蛋白溶液，加入5 mL测试液（pH 8.0的Tris-甘氨酸缓冲液用于暴露巯基含量的测定，Tris-甘氨酸-8 mol/L尿素溶液用于总巯基含量的测定），添加100 μL DTNB溶液（4 mg/mL），在25 ℃恒温摇床中振荡1 h后，于7 000×g离心10 min，得到上清液，以2 mL蒸馏水加5 mL测试液、100 μL DTNB为空白对照，然后测定其在412 nm波长处的吸光度。按下式计算巯基含量。

式中：A412nm为412 nm波长处的吸光度；ρ为蛋白质量浓度/（mg/mL）；D为稀释倍数；73.53为106/（1.36×104），其中1.36×104是摩尔消光系数/（L/（mol·cm））。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 单孔孔板水力空化和超声空化的空化产额比较

表1 单孔孔板水力空化和超声空化的空化产额的计算及比较Table 1 Comparison of cavitation yields of ultrasonic and hydrodynamic cavitation

单孔孔板水力空化和超声空化的空化产额计算及二者之间的比较如表1所示。在相同的输入功率、处理时间和体积下，单孔孔板水力空化处理对苯二甲酸得到的产物2-羟基对苯二甲酸的浓度为1.34×10－5mol/L，而超声空化处理得到的产物浓度为1.91×10－6mol/L，单孔孔板水力空化的空化产额约是超声空化的7 倍。Kumar等[18]利用碘化钾的方法来比较孔板水力空化和超声空化的空化产额时发现，孔板水力空化的空化产额是超声空化的2～3 倍，并且他们认为超声空化产额较低的原因是超声波的能量利用率较低，而水力空化装置中用到泵，该泵的能量利用率随着单位时间内处理体积的增加而增大，因此水力空化在处理大体积样品时其空化产额较高。

2.2 单孔孔板水力空化对大豆球蛋白理化性质的影响

2.2.1 SDS-PAGE分析

图2 单孔孔板水力空化对大豆球蛋白分子质量的影响Fig. 2 Effect of hydrodynamic cavitation in single-hole orifice plate on molecular mass of soybean globulin

如图2所示，还原条件下的SDS-PAGE图谱清晰地显示出大豆球蛋白的特征条带，其中酸性多肽（acidic subunit，AS）分子质量约为35 kDa，碱性多肽（basic subunit，BS）分子质量约为20 kDa，但是也混有少量的β-伴大豆球蛋白的β亚基条带（分子质量约为52 kDa），通过光密度分析，大豆球蛋白纯度可达85%以上。从还原条件下的SDS-PAGE图谱中还可以看出，单孔孔板水力空化处理未引起大豆球蛋白各条带位置的变化，说明单孔孔板水力空化处理未改变大豆球蛋白的分子质量分布。超声波在处理蛋白质时，很多情况下也未引起蛋白质分子质量发生改变。如Hu Hao等[2]在研究超声波处理大豆分离蛋白时，大豆分离蛋白在不同超声波功率（200～600 W）下处理15～30 min后其分子质量分布未发生变化。O'Sullivan等[19]发现超声波处理也未能改变小麦蛋白和大豆分离蛋白的分子质量分布，他们认为实验中超声波提供给被处理样品的能量不足以让肽键和二硫键断裂，只能破坏一些非共价键。

从图2非还原条件下的SDS-PAGE图谱中可知，由于非还原电泳处理样品时未添加β-巯基乙醇，即未打开蛋白质分子的二硫键，AS和BS之间通过二硫键形成AB亚基分布在43.0～66.2 kDa之间，条带没有变化，说明二硫键未出现断裂，也没有新的二硫键生成。但是，Hu Hao等[17]利用超声波处理大豆球蛋白时发现，非还原条件下SDS-PAGE图谱中大分子质量处由二硫键形成的聚集物有所增加。这与本研究的结果不一致，说明不同的处理方式对大豆球蛋白亚基结构的影响不同。

2.2.2 粒径分布

由图3可知，未处理的大豆球蛋白粒径呈多峰分布，共有3 个峰，分别在0～100、100～1 000、1 000～10 000 nm处。经单孔孔板水力空化处理后，其粒径分布发生变化。处理5 min后，在1 000～10 000 nm处的峰仍然存在，但是其强度变弱；处理10 min后，在1 000～10 000 nm处的峰消失。处理之后的样品，粒径分布在0～100 nm和100～1 000 nm处的峰都向左偏移。

图3 单孔孔板水力空化对大豆球蛋白粒径分布的影响Fig. 3 Effect of hydrodynamic cavitation in single-hole orifice plate on particle size distribution of soybean globulin

图4 单孔孔板水力空化对大豆球蛋白平均粒径的影响Fig. 4 Effect of hydrodynamic cavitation in single-hole orifice plate on average particle size of soybean globulin

从图4可以看出，单孔孔板水力空化处理可显著降低大豆球蛋白的平均粒径（P＜0.05），处理30 min后大豆球蛋白的平均粒径由（335.67±3.43）nm减小至（234.73±4.32）nm。大豆球蛋白平均粒径的减小可能是由于单孔孔板水力空化产生的空化效应如高剪切力、冲击波、微射流以及湍流等作用，破坏了蛋白质分子间的作用力，使大豆球蛋白中大的聚集体解离成小的聚集体。Yang Feng等[12]的研究结果也表明基于涡流的水力空化在0.6 MPa下处理60 min，能使大豆分离蛋白的粒径从（115.43±5.89）μm减小至（15.93±3.94）μm。关于超声波处理对不同蛋白质粒径的影响也有报道，如Jambrak等[1,20]研究发现超声波处理使大豆蛋白和乳清蛋白的平均粒径减小。Hu Hao等[17]的研究结果表明经400 W超声波处理40 min后β-伴大豆球蛋白的平均粒径从75.9 nm减小至51.8 nm。他们认为粒径的减小可能是超声波产生的空化效应破坏了蛋白分子间的相互作用，使聚集体解离引起的。由此可见，单孔孔板水力空化同涡流水力空化和超声波等物理改性方式效果相当，都能引起蛋白质分子中聚集体的解离，从而导致其平均粒径减小。但是，需要说明的是，超声波处理也能引起蛋白质分子的聚集，而使其平均粒径增加。如Arzeni等[21]利用超声波处理蛋清蛋白、Gülseren等[22]利用超声波处理牛血清蛋白时，发现这些蛋白质经超声波处理后能产生一些小的聚集体而使其平均粒径增加。这可能与超声波处理时所用的功率和时间不同以及处理样品的浓度、组成及构象不同有关。

2.2.3 Zeta电位

图5 单孔孔板水力空化对大豆球蛋白Zeta电位的影响Fig. 5 Effect of hydrodynamic cavitation in single-hole orifice plate on zeta potential of soybean globulin

Zeta电位可以反映蛋白质表面电荷的分布情况。通常，当蛋白质表面带负电荷的氨基酸多于带正电荷的氨基酸时，其Zeta电位为负值，反之则为正值[23]。Zeta电位的绝对值越大，表明体系越稳定。由图5可以看出，大豆球蛋白经单孔孔板水力空化处理5 min后，其Zeta电位绝对值显著增加（P＜0.05）；延长处理时间，Zeta电位绝对值继续增加，但是增加程度不显著（P＞0.05）。未处理时大豆球蛋白Zeta电位绝对值为（24.47±0.51）mV，处理30 min后其Zeta电位绝对值增加至（31.30±2.74 ）mV。这可能是因为，单孔孔板水力空化产生的空化效应改变了蛋白分子结构，使更多带负电荷的氨基酸残基暴露于蛋白分子表面，导致Zeta电位绝对值增加。另外，大豆球蛋白经空化处理后平均粒径减小（图4），蛋白分子中一些大的聚集体解聚，让更多的带负电荷的氨基酸残基暴露于分子表面，也使Zeta电位绝对值增加。Gülseren等[22]研究结果表明超声波处理使牛血清白蛋白的分子结构和构象发生变化，处理45 min后Zeta电位绝对值从处理前的27.4 mV增加至36.3 mV。Nazari等[24]发现，超声波处理能使粟米浓缩蛋白分子表面暴露更多的带负电荷的氨基酸残基，Zeta电位的绝对值由32.9 mV增加到42.2 mV。由此可见，单孔孔板水力空化与超声波处理一样能使蛋白质分子结构发生改变，更多的带负电荷的氨基酸残基暴露于蛋白分子表面，使Zeta电位绝对值增加，但是增加的程度与处理方式有关。

2.2.4 内源荧光光谱

色氨酸内源荧光光谱是一种比较灵敏的在三级结构水平反映蛋白质构象变化的技术手段。内源荧光光谱最大吸收峰（λmax）向长波长方向移动（红移）表明蛋白质的结构变得松散，色氨酸处于极性更大环境中；λmax向短波长方向移动（蓝移），表明蛋白质分子结构变得紧凑，色氨酸处于疏水性更大的环境中；若λmax没有发生偏移，仅仅有荧光峰信号增强或减弱，则不能将其判断为明显的蛋白构象改变[25]。如图6所示，经单孔孔板水力空化处理30 min后，大豆球蛋白的λmax从329 nm红移至333 nm，说明大豆球蛋白分子结构发生变化，色氨酸处于极性更大的环境中，这可能是因为单孔孔板水力空化产生的高剪切力、冲击波、微射流及湍流等空化效应破坏了蛋白质分子间的相互作用力，使其结构变得更加松散，色氨酸的微环境变得更加亲水。Jiang Lianzhou等[15]研究超声波处理对黑豆分离蛋白的影响，发现经超声波处理后，蛋白样品的λmax红移，表明超声波破坏了蛋白分子间的相互作用，使色氨酸基团暴露于外界，导致它们微环境的极性增加，这与本研究结果一致。由图6还可以看出，经单孔孔板水力空化处理后大豆球蛋白的荧光强度增加，这可能是因为单孔孔板水力空化处理使大豆球蛋白分子中暴露的色氨酸发色团与荧光猝灭剂的相互作用减弱引起的[26]。

图6 单孔孔板水力空化对大豆球蛋白内源荧光光谱的影响Fig. 6 Effect of hydrodynamic cavitation in single-hole orifice plate on intrinsic emission fluorescence spectrum of soybean globulin

2.2.5 表面疏水性

图7 单孔孔板水力空化对大豆球蛋白表面疏水性的影响Fig. 7 Effect of hydrodynamic cavitation in single hole orifice plate on surface hydrophobicity of soybean globulin

蛋白质表面疏水性的大小取决于其疏水性基团的暴露程度，是影响蛋白质的功能性质如乳化性和起泡性的重要因素[27]。如图7所示，大豆球蛋白经单孔孔板水力空化处理10 min后，其表面疏水性未发生显著变化（P＞0.05），但是处理20 min后，其表面疏水性显著增加（P＜0.05），处理30 min后表面疏水性由处理前的1 970.67±35.00增加至2 373.67±75.57。之前的研究结果也表明经涡流空化处理过的大豆分离蛋白的表面疏水性是未处理组的2 倍[12]。常海霞等[28]发现草鱼肌肉肌原纤维蛋白经超声波处理后包埋在分子内部的疏水性氨基酸残基暴露至分子表面，处理20 min后其表面疏水性增加3.8 倍。本研究中大豆球蛋白表面疏水性的增加意味着在单孔孔板水力空化处理过程中大豆球蛋白结构的展开和疏水性基团的暴露，图5中Zeta电位绝对值的增加也印证了这一点。此外，如图4所示，单孔孔板水力空化处理后大豆球蛋白的粒径减小，说明空化效应破坏了分子之间的交联作用，使一些大的聚集体解聚，也导致一些疏水性基团暴露，从而导致表面疏水性增加。

2.2.6 巯基含量

图8 单孔孔板水力空化对大豆球蛋白巯基含量的影响Fig. 8 Effect of hydrodynamic cavitation in single-hole orifice plate on exposed and total sulfhydryl contents of soybean globulin

巯基基团是蛋白质中活性最强的官能团之一，也是影响蛋白质功能性质的重要因素[26]。由图8可以看出，经单孔孔板水力空化处理后，暴露巯基和总巯基含量随着空化时间的延长而降低，处理30 min后暴露巯基和总巯基含量分别由未处理的（5.11±0.35）μmol/g和（7.31±0.27）μmol/g降低至（3.76±0.16）μmol/g和（5.35±0.28）μmol/g。暴露巯基和总巯基含量的降低可能是巯基和二硫键之间发生互相转换，但是结合前面SDS-PAGE图谱（图2）来看，在非还原条件下，大豆球蛋白的各个条带位置并未发生变化，没有新的条带出现，说明没有新的二硫键形成，因此减少的巯基并没有形成二硫键。值得注意的是，空化效应中一个很重要的效应是水分子断裂产生自由基，如·H和·OH，·OH具有强氧化性，可以将巯基氧化成次磺酸或磺酸基，导致巯基含量降低。常海霞等[28]在研究超声波对草鱼肌肉肌原纤维蛋白理化性质的影响时也发现超声波空化效应产生的·OH也使肌原纤维蛋白分子的暴露巯基和总巯基含量均减少。Hu Hao等[17]也发现超声波处理使大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的暴露巯基和总巯基含量均减少，这些与本研究结果一致。

2.3 各理化指标之间的相关性

表2 大豆球蛋白各理化指标之间的相关性分析Table 2 Pearson correlation coefficients of physicochemical properties of soybean globulin

为了更好地了解单孔孔板水力空化处理大豆球蛋白平均粒径、Zeta电位绝对值、表面疏水性、暴露巯基含量和总巯基含量等理化指标之间的关联，对这些理化指标进行相关性分析，结果如表2所示。大豆球蛋白的平均粒径与Zeta电位绝对值之间存在显著负相关（r=－0.900）（P＜0.05），与暴露巯基含量（r=0.933）和总巯基含量（r=0.959）之间均存在显著正相关（P＜0.05、P＜0.01）；Zeta电位绝对值与总巯基含量之间存在显著负相关（r=－0.894）（P＜0.05）；表面疏水性与暴露巯基含量之间存在显著负相关（r=－0.928）（P＜0.05）；暴露巯基含量与总巯基含量之间存在极显著正相关（r=0.959）（P＜0.01）。这些结果表明，在单孔孔板水力空化处理过程中，随着大豆球蛋白平均粒径的减小，大的聚集体解聚，更多的带负电荷的氨基酸残基暴露，Zeta电位绝对值增加；由于蛋白分子展开导致更多的疏水性氨基酸残基也暴露出来，蛋白表面疏水性增加。但是蛋白分子的展开并没有引起暴露巯基含量的增加，而是使其减小（图8），其原因可能是暴露巯基瞬间被空化过程中产生的·OH氧化，并且被氧化的速率大于其暴露的速率。

3 结 论

大豆球蛋白经单孔孔板水力空化处理后，分子质量分布未发生变化，平均粒径减小，Zeta电位绝对值增加，内源荧光光谱最大吸收峰红移，表面疏水性增加，暴露巯基含量和总巯基含量均降低。由此可见，单孔孔板水力空化对大豆球蛋白的改性有一定效果，这对丰富食品蛋白质的物理改性途径、将水力空化技术应用到食品蛋白质的生产中具有一定意义。关于单孔孔板水力空化处理对大豆球蛋白功能性质的影响以及对β-伴大豆球蛋白理化和功能性质的影响有待进一步研究。