CO2背压啤酒发酵中乙酰辅酶A与酿酒酵母生长和酯类生成的相关性分析

杨东升，刘 腊，李 鹏

（海南大学 材料与化工学院，海南 海口 570228）

乙酰辅酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA）是酶法合成酯类、脂质、萜类等具有重要工业应用价值的化合物的重要合成前体，参与了微生物中100多条合成与分解代谢途径[1]，它既是合成酵母细胞组成物质的关键物质，又是是酯类形成的主要限制因子[2]。乙酰辅酶A是生物合成脂肪酸的基础，也是生物合成酯类的构成物，酯的合成与脂肪酸的合成存在着对酰基辅酶A的竞争机制，因此，有利于脂肪酸的合成，会影响酯的合成[3-4]。酯类是影响啤酒风味最大和最重要的化合物之一，尽管啤酒中的酯类含量不高，但其对啤酒风味的影响非常大。合理控制啤酒中酯类含量，将赋予啤酒协调的风味[5]。

当环境条件有利于酵母的生长繁殖时，例如麦汁中含有足量的可同化氮并在好气条件下，酵母需要合成较多的脂肪酸来合成细胞膜进行繁殖时，酯的合成就会减少。任何影响乙酰辅酶A的生物合成或消耗乙酰辅酶A的反应都会影响酯的生物合成。相反，环境条件不利于酵母的生长繁殖时，如在缺少可同化氮或培养基营养成分不均衡的情况下，酵母较快通过糖酵解形成大量乙酰辅酶A，并以此为底物合成大量酯[6]。特别是啤酒高浓发酵，造成成品啤酒强烈的溶剂味，形成风味缺陷[7]。

CO2是啤酒发酵过程自生产物，在密封的啤酒发酵环境中，其浓度会越来越高直至发酵停止。CO2能影响酵母的代谢途径，改变代谢产物的种类、生成速率和产量[8]。CO2可以直接抑制酵母的生长和代谢，尤其是抑制对酵母代谢起关键作用的脱羧反应，脱羧反应的减少进而影响酯类合成底物乙酰辅酶A的形成[9]。另外，一些酶蛋白上可能存在一个特定的阴离子敏感位点，其会受到HCO-3的抑制[10]，使代谢方向发生改变。如在一定压力范围内，随着外加CO2分压的上升，使更多的丙酮酸作为反应底物通过生成乙醛转化成酒精[11-12]，从而减少乙酰辅酶A的形成，进而影响酯的生成。研究发现[13]，低浓度CO2可以刺激酵母的生长。合理的背压可以控制丙酮酸到乙酰辅酶A的脱羧过程对CO2抑制的敏感度。比如，现代啤酒发酵通过密封罐调整背压确保发酵过程的顺利进行，尤其是大规模的高浓度和超高浓度啤酒发酵技术使发酵环境压力、CO2浓度更高，对酵母生长代谢及酯类代谢的影响更是不能忽视[7]。综上，保持合理的CO2背压非常重要，除了可以控制酵母生长速度，又可以控制乙酰辅酶A的消耗，导致影响酯的形成。然而，现有研究CO2对啤酒生产影响仅局限于单一的因素分析，未能充分揭示在CO2背压下，乙酰辅酶A与酵母生长、酯类形成的相关性。

本研究通过控制比较啤酒背压发酵与常压发酵，通过检测主发酵过程中乙酰辅酶A、酵母生长和酯类形成的变化，分析CO2对啤酒发酵基本参数的影响，揭示乙酰辅酶A与酿酒酵母生长和酯类生成的规律，对指导生产适宜风味的啤酒具有十分重要的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）NCYC 1108、麦汁（12°Bx）：海南大学生物工程综合实验室；柠檬酸合酶（100 U/m L）：美国Sigma公司；疏基乙醇、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、甘油、Tris-HCl（pH=7.5）、苹果酸脱氢酶（30.4 kU/m L）、L-苹果酸、氧化型辅酶I（β-nicotinam ide adenine dinucleotide trihydrate，NAD）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯（均为分析纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

100L啤酒自酿系统：哈尔滨汉德啤酒有限公司；JY92IIN超声波细胞破碎仪：上海沪析实业有限公司；5424高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；6890N气相色谱（gaschromatography，GC）仪：美国Agilent公司；TU-1810紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；MLS3780高压蒸汽灭菌锅：三洋电机株式会社；ATY224岛津电子天平：日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1 啤酒常压发酵和CO2背压发酵工艺流程及操作要点

CO2背压发酵：关闭排空阀，高泡期形成后，使压强自动上升至0.05MPa，保持，如果压力继续升高，则通过排气保持压力，发酵温度10℃。

常压发酵：排空阀保持常开，发酵温度10℃。

1.3.2 分析检测

（1）酵母计数[14]

酵母计数采用血球计数板法。

（2）乙酰辅酶A含量测定[15]

乙酰辅酶A提取试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）2.5 g、100mmol/L的巯基乙醇37μL、100mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF）500μL和甘油5m L溶于50mmol/L，pH值为7.5，100m L的Tris-HCl缓冲溶液后组成，置于试剂瓶中，4℃保存[15]。

乙酰辅酶A检测试剂：苹果酸脱氢酶0.3mg，柠檬酸合酶10 μL，苹果酸30mg和氧化型辅酶I（NAD）7.5mg溶于50mmol/L，pH值为7.5，23m L的Tris-HCl缓冲溶液中[15]。

样品制备：取20 m L发酵液于50 m L无菌离心管中，5 000 r/min离心15min，收集离心沉淀，用生理盐水洗涤酵母菌体两次。弃上清，沉淀按照每400万细菌或培养细胞加入1m L的乙酰辅酶A提取试剂，并且采用功率为20W的超声波，对离心管内的细菌或培养细胞超声3 s，间隔10 s，重复30次，破碎细胞，然后采用13 000×g离心条件，4℃离心10m in，取上清，置冰上，用于测定乙酰辅酶A[15]。

乙酰辅酶A含量测定[15]：分光光度计预热30min，用蒸馏水于波长340 nm处调零；取230μL的乙酰辅酶A检测试剂和25μL样本至微量石英比色皿，混匀；立即记录波长340 nm处20 s时的吸光度值A1和80 s时的吸光度值A2；计算吸光度值ΔA=A2-A1；以吸光度值ΔA（x）为横坐标，以标准品浓度（y，nmol/mg）为纵坐标，绘制乙酰辅酶A标准曲线，采用乙酰辅酶A标准曲线回归方程y=1 640x+0.012计算样品中乙酰辅酶A含量。

（3）总酯含量测定

采用顶空气相色谱法测定乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯。气相色谱条件如下：采用毛细管HP-NIONAX柱（30m×0.32mm×0.25μm），顶空采样器HP7694E，注入温度225℃；柱温程序：在40℃条件下保持3min，然后在5℃/min增加到90℃；检测器温度300℃；载气为氮气（N2）；载气流量30m L/m in；氢气（H2）流量40m L/m in；空气流量400m L/m in；分流比6∶1；样品瓶平衡温度50℃；平衡时间30m in；循环温度60℃；传输线温度65℃，进样量0.5μL。工作站软件PG2070AA[16-17]。根据保留值进行定性分析，利用外标法（标准曲线法）进行定量计算。

1.3.3 统计方法

所有数据均为3次平行实验结果的平均值。相关性分析采用SAS9.0统计软件。其中P＜0.01表示两因素极显著相关；P＜0.05表示两因素显著相关[18]。

2 结果与分析

2.1 CO2背压与常压啤酒发酵中乙酰辅酶A、酵母细胞数量及总酯含量及减少率的变化

研究常压和CO2背压条件下啤酒发酵中乙酰辅酶A、酵母细胞数量及总酯含量变化，结果见图1。

图1 常压与CO2背压啤酒发酵中乙酰辅酶A、酵母细胞数量及总酯含量变化Fig.1 Changes of acetylcoenzyme A,yeast cellnumber and total ester content in beer fermentation under atmospheric pressure and CO2 top pressure conditions

由图1可知，乙酰辅酶A含量在发酵初期（0～20 h）急速增长，并在20 h时达到峰值（常压和CO2背压条件下分别为17 nmol/mg和12 nmol/mg），乙酰辅酶A含量受压力影响明显；发酵时间为20～60 h时乙酰辅酶A含量急剧减少，常压和CO2背压分别减少至8.6 nmol/mg和7.7 nmol/mg；发酵时间为60～100 h，乙酰辅酶A含量缓慢降低，常压和CO2背压分别降低至7.8 nmol/mg和7.5 nmol/mg；发酵时间＞100 h之后，常压和CO2背压条件下啤酒发酵中乙酰辅酶A含量均趋于稳定一致。

由图1可知，在常压发酵条件下，酵母细胞数量在0～100 h逐渐增加，并在100 h时达到峰值，为3×107个/m L，发酵时间＞100 h之后，酵母细胞数量逐渐下降；在CO2背压发酵条件下，酵母细胞数量在0～140 h逐渐增加，并在140 h时达到峰值，为3.5×107个/m L，发酵时间＞140 h之后，酵母细胞数量逐渐下降。两种发酵条件下酵母细胞数量在180 h之后趋于一致。

由图1可知，在常压发酵条件下，总酯的含量在0～100h逐渐增加，并在100 h时达到峰值，为35mg/L，发酵时间＞100 h之后，总酯的含量趋于稳定；在CO2背压发酵条件下，总酯含量在0～180 h逐渐增加，并在180 h时达到峰值，为28mg/L，发酵时间＞180 h之后，总酯含量趋于稳定。常压发酵条件下总酯含量始终高于CO2背压发酵。

由图1可得初步结论，CO2背压令乙酰辅酶A减少，同时抑制酵母细胞生长及总酯的生成，使酵母细胞生长及总酯含量生成峰值滞后。CO2背压啤酒发酵中乙酰辅酶A、酵母细胞数量及总酯含量减少率结果见图2。

图2 CO2背压引起啤酒发酵中乙酰辅酶A、酵母细胞数量及总酯含量减少率Fig.2 Reduction rate of acetyl coenzyme A,cellnum ber and totalester content in beer fermentation under CO2 top pressure conditions

由图2可知，乙酰辅酶A主要活跃在啤酒发酵0～120h，其中在0～20 h乙酰辅酶减少率上升，并在20 h时乙酰辅酶减少率达到最大，在20～120 h减少率下降，120 h之后减少率稳定。120 h之后对乙酰辅酶A含量影响不大；酵母酵母细胞减少率在0～60 h范围逐渐增大，并在60 h时达到最大，酵母酵母细胞减少率在60～180 h范围急剧减少，酵母酵母细胞减少率在发酵时间＞180h之后变化不大；总酯含量减少率在0～20 h范围逐渐增大，并在20 h时达到最大，总酯含量减少率在20～180 h范围逐渐减少，在发酵时间＞180 h之后变化不大。CO2背压对酯生成的影响从其他研究中可以得到相似的结果，10 d的啤酒压力发酵抑制了酵母的繁殖和一些风味物质的生成。CO2背压对乙酰辅酶A的主要影响时段为0～120h，120h后未见影响；对酵母数量和总酯含量影响的主要时段为0～180 h，180 h后未见影响。

2.2 常压与CO2背压啤酒发酵乙酰辅酶A与酵母数量的相关性

常压与CO2背压啤酒发酵乙酰辅酶A与酵母数量的相关性见图3。

图3 常压（A）和CO2背压（B）啤酒发酵乙酰辅酶A与酵母数量的相关性Fig.3 Correlation between acetyl coenzyme A and yeast cellnumber in beer ferm entation under atm ospheric pressure(A)and CO2 top pressure(B)conditions

由图3A可知，常压条件下啤酒发酵中乙酰辅酶A含量与酵母数量呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数R=0.93717。由图3B可知，背压条件下啤酒发酵中乙酰辅酶A含量与酵母数量同样呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数R=0.905 66。

在酵母生长过程中，有很大一部分的碳代谢流通过乙酰辅酶A合成酶途径形成乙酰辅酶A，并参与到其他的细胞器的重要化合物的合成反应中去。因此，乙酰辅酶A的减少将直接影响到酵母数量的减少[5]。

施加CO2背压啤酒发酵后，乙酰辅酶A减少率与酵母数量减少率的相关性见图4。由图4可知，乙酰辅酶A减少率与酵母数量减少率呈显著正相关（P＜0.05），相关系数R=0.803 48。说明在CO2背压影响下，酵母数量减少极有可能是乙酰辅酶A减少引起的。酿酒酵母中最丰富的酰基辅酶A是乙酰辅酶A，它可以通过丙酮酸的氧化脱羧或用三磷酸腺苷直接激活乙酸而形成[4]。这是发生在酵母细胞内的反应，在压力的作用下，丙酮酸的氧化脱羧作用受阻[9]，减少乙酰辅酶A的生成，同时乙酸受压力影响渗出胞外增加，使得可用于激活的乙酸随之减少[19-20]。酵母生长可利用的乙酰辅酶A减少，细胞数量相应减少。

图4 乙酰辅酶A减少率与酵母数量减少率的相关性Fig.4 Correlation between acetyl coenzyme A reduction rate and yeast cellnumber reduction rate

2.3 常压与CO2背压啤酒发酵乙酰辅酶A与总酯含量的相关性

常压与CO2背压啤酒发酵乙酰辅酶A与总酯含量的相关性见图5。由图5可知，常压条件下啤酒发酵中乙酰辅酶A含量与总酯含量呈显著负相关（P＜0.01），相关系数r=-0.83396。CO2背压条件下啤酒发酵中乙酰辅酶A含量与总酯含量呈负相关，相关系数r=-0.750 42。乙酰辅酶A是生物合成脂肪酸的基础，也是生物合成酯类的构成物，酯的合成与脂肪酸的合成存在着对酰基CoA的竞争机制，因此，有利于脂肪酸的合成，会影响酯的合成[3]。换言之，乙酰辅酶A含量的增加有利于酵母生长，会影响酯的合成。

图5 常压（A）和CO2背压（B）啤酒发酵乙酰辅酶A与总酯含量的相关性Fig.5 Correlation between acetyl coenzyme A and totalester content in beer fermentation under atmospheric pressure(A)and CO2 top pressure(B)conditions

乙酰辅酶A的量的分配决定了生化途径的走向和强度，乙酰辅酶A也因此成为一个衡量碳流向的蓄水池，其“水位”的高位决定了酯合成的强度、脂质和氨基酸合成量的大小[4]。结合图1，乙酰辅酶A是酵母细胞生长的先决条件，不管施压与否，乙酰辅酶A的生成总是先于酯的合成。乙酰辅酶A的消耗用于酯的合成，因此两者呈负相关的关系。

施加CO2背压后，乙酰辅酶A减少率与总酯含量减少率的相关性见图6。由图6可知，在CO2背压影响下，乙酰辅酶A减少率与总酯含量减少率呈显著正相关（P＜0.01），相关系数r=0.800 29。乙酰辅酶A除了参与细胞内的许多其他反应，包括脂质和氨基酸的生物合成，以及三羧酸循环以外，还参与酯的合成[4]。在乙酰辅酶A的总量控制方面，如果在发酵系统中添加脂质（如长链饱和脂肪酸）就可以减少酵母细胞合成对乙酰辅酶A的需求，增加酯的合成，然而施加CO2背压结果完全相反，乙酰辅酶A的总量因此减少，不单细胞合成受到抑制，酯的合成也受到影响。乙酰辅酶A减少率与总酯含量减少率遵循的这种相关关系，反映了在CO2背压下，乙酰辅酶A对总酯生成的重要性。

图6 乙酰辅酶A减少率与总酯含量减少率的相关性Fig.6 Correlation between acetyl coenzyme A reduction rate and totalester content reduction rate

在正常情况下，酵母需要合成较多的脂肪酸来合成细胞膜进行繁殖时，酯的合成就会减少。任何影响乙酰辅酶A的生物合成或消耗乙酰辅酶A的反应都会影响酯的生物合成。环境条件不利于酵母的生长繁殖时，如在CO2背压的情况下，乙酰辅酶A生成受阻，优先供酵母生长所需，并不会合成大量酯。

3 结论

乙酰辅酶A主要活跃在啤酒发酵0～120 h，乙酰辅酶A含量在发酵初期（0～20h）急速增长，并在20h时达到峰值，常压和CO2背压条件下分别为17 nmol/mg和12 nmol/mg，发酵时间＞100 h之后，常压和CO2背压发酵条件下啤酒发酵中乙酰辅酶A含量均趋于稳定一致。常压和CO2背压条件下酵母细胞数量分别在100 h、140 h时达到峰值，两种发酵条件下酵母细胞数量在180 h之后趋于一致。在常压和CO2背压发酵条件下，总酯的含量分别在100 h、180 h时达到峰值，发酵时间＞180 h之后，总酯含量趋于稳定。常压发酵条件下总酯含量始终高于CO2背压发酵。常压与CO2背压条件下啤酒发酵中乙酰辅酶A含量与酵母数量均呈极显著正相关（P＜0.01）。常压条件下啤酒发酵中乙酰辅酶A含量与总酯含量呈显著负相关（P＜0.01），CO2背压条件下啤酒发酵中乙酰辅酶A含量与总酯含量呈负相关。