结直肠癌患者血浆circPRMT5表达水平及临床意义

王洪伟 王琳琳 张翼飞 于永生 刘玉伟 李重 刘欣然

结直肠癌是高发病率和高死亡率的消化系统恶性肿瘤［1］。早期发现、早期诊断成为改善结直肠癌治疗效果的重要手段。血浆中非编码RNA分子的检测，能够有助于肿瘤的早期诊断［2］。环状RNA（circRNA）是一类新发现的非编码RNA分子，是具有闭环结构的小RNA分子［3］。circRNA分子形成的机制主要包括“外显子跳跃”和前体mRNA的“反向剪切”两种方式［4-5］。尽管很早就有研究发现了真核细胞中存在circRNA分子，但是早期的理论认为circRNA分子是无功能的“垃圾”分子。近些年来，随着深度测序技术的不断应用，人们发现了大量的外显子或内含子circRNA，这说明了circRNA并不是错误剪切的产物，而是具有多种调控功能的RNA分子［2］。circRNA因为其独特的环状结构，使得其不易降解，是具有前景的分子标志物。已经有研究发现了血浆中的circRNA分子与患者的生存密切相关［6］。这提示我们血浆circRNA可以作为潜在的分子标志物。

本文通过高通量芯片技术对结直肠癌患者血浆circRNA分子进行筛选，发现circPRMT5在结直肠癌患者血浆中高表达。同时，我们发现血浆circPRMT5与结直肠癌患者的生存密切相关，也是预测结直肠癌患者预后的独立因素。因此，本研究发现血浆circPRMT5是结直肠癌肿瘤中新的分子标志物。

资料与方法

一、血浆样本与临床信息

276例非转移性结直肠癌患者与37例正常人群血浆样本来源于2012年1月至2013年1月哈尔滨医科大学附属第四医院普外科，正常人群均经过肠镜证实无肠道肿瘤。所有患者经肠镜检查，病理明确为腺癌，肝脏MRI和肺脏CT排除患者远处器官转移。所有患者临床信息完整，定期随访。总生存时间定义为患者确诊结直肠癌日期至患者死亡日期，无复发生存时间定义为患者确诊结直肠癌日期至第一次诊断复发日期。在确诊之后，手术之前，获得10 mL患者血液样本，3 000 rpm离心后，分离获得血浆成分，分装后，液氮速冻，置于-80 ℃冰箱中保存。肿瘤TNM分期根据第六版UICC肿瘤分期标准。本研究经过哈尔滨医科大学附属第四医院伦理委员会批准，所有实验过程符合赫尔辛基宣言，并且在实验开始前所有患者均签署知情同意书。

二、血浆RNA的提取

使用Qiagen公司miRNeasy Serum Plasma Advanced Kit试剂盒。取200 μL血浆，加入60 μL RPL缓冲液，涡旋至少5秒后，室温下静置3 min。加入20 μL RPP缓冲液，涡旋至少20 s后，室温下静置3 min。室温下12 000 g离心3 min，弃掉沉淀，将上清转移到新的离心管中，加入1倍体积的异丙醇，涡旋充分混匀；将全部混合液转移到RNeasy UCP MinElute柱中，8 000 g离心15 s，弃掉穿流液；向RNeasy UCP MinElute柱加入700 μL RWT缓冲液，8 000 g离心15 s，弃掉穿流液；向RNeasy UCP MinElute柱中加入500 μL RPE缓冲液，8 000 g离心15 s，弃掉穿流液；向RNeasy UCP MinElute柱 中 加 入 500 μL 80% 的 乙 醇，8 000 g离心2 min，弃掉穿流液；将RNeasy UCP MinElute柱置于2 mL新的收集管中，8 000 g离心5 min，弃掉穿流液和收集管；将RNeasy UCP MinElute柱置于1.5 mL的收集管中，加入20 μL无RNA酶水，室温孵育1 min，8 000 g离心1 min，洗脱RNA。

三、RNA的提取和芯片杂交

根据ArrayStar公司标准。提取RNA后，经过RnaseR消化去除线性RNA，使用Arraystar Super RNA Labeling Kit试剂盒扩增并荧光标记circRNA分子。而后，将标记的circRNA分子与ArrayStar人类circRNA分子芯片杂交，之后使用Agilent Scanner G2505C扫描芯片。芯片图像使用Agilent Feature Extraction软件分析，表达倍数大于2并且P值小于0.05认为是具有差异表达的circRNA。所有患者每1个月规律电话随访，询问患者生存状态与复发状态。无复发生存时间定义为手术日期至第一次临床确诊复发日期之间的时间间隔，删失数据定义为手术日期至幸存者最后一次随访日期之间的时间间隔。

四、统计学分析

所有统计学分析使用SPSS 23.0。circPRMT5与患者临床病理参数之间的关系，采用卡方检验；计数参数之间的比较，采用独立样本t检验或者非参数检验。总生存时间和无复发生存时间之间的比较，采用Kaplan-Meier和对数秩检验法，预后相关的独立因素分析，采用COX回归分析；P＜0.05认为差异具有统计学意义。

结 果

一、结直肠癌患者血浆circRNA表达谱

为了研究结直肠癌患者血浆circRNA的差异表达，我们采用了circRNA芯片技术，分析比较了5例结直肠癌患者血浆与5例正常人群血浆circRNA的表达情况。差异circRNA的表达如火山图所示（图1），我们共筛选获得到31个高表达的circRNA分子和38个低表达的circRNA分子。在高表达circRNA中，有26个外显子circRNA，3个内含子circRNA和2个反义circRNA分子；在低表达circRNA中，有25个外显子circRNA，6个内含子circRNA，5个基因间circRNA和2个反义circRNA分子。我们选取了在结肠癌患者血浆中表达最高的circPRMT5作为后续研究的目标分子。而后收集了276例结直肠癌患者的血浆和37例正常人群的血浆，通过PCR技术检测证实，circPRMT5在结直肠癌患者血浆中高表达，为10.33±3.41；正常人群为8.77±3.74（t=2.58，P=0.01）。

图1 circRNA表达火山图

二、研究人群的一般特征

我们收集了本科室276例结直肠癌患者的血浆样本，通过PCR的方法检测了circPRMT5的表达，根据表达量的中位值，将人群分为高表达组和低表达组。比较了年龄、性别、肿瘤TNM分期、淋巴结清扫数目、血管瘤栓、淋巴管瘤栓和神经侵犯等病理指标。通过比较发现circPRMT5高表达组患者的年龄更高，男性患者比例较多。circPRMT5高表达组患者肿瘤分期更晚，淋巴结转移数目越多，并且不良预后相关的病理因素更多（表1）。

三、circPRMT5是预测结直肠癌患者不良预后的独立因素

为了进一步研究circPRMT5在结直肠癌患者中的临床意义，我们对276例患者进行了随访，中位随访时间为38个月，通过Kaplan-Meier生存曲线，比较了circPRMT5高表达组与低表达组之间的生存差异，发现高表达circPRMT5的患者生存时间明显短于低表达circPMRT5组患者（图2，Log rank P=0.006）。同时高表达circPRMT5的患者的无复发生存时间明显短于低表达circPRMT5（图3，Log rank P=0.025）。进一步寻找影响患者生存的因素，我们采用了单因素和多因素COX回归分析，通过分析我们发现circPRMT5的表达水平是判断患者总生存时间与无复发生存时间的独立危险因素（表2）。

表1 患者一般病理特征（例）

图2 患者总生存时间的比较

图3 患者无复发生存时间的比较

表2 circPRMT5表达水平是患者总生存时间与无复发生存相关的独立危险因素

讨 论

在本研究中，通过circRNA芯片筛选我们发现了circPRMT5在结直肠癌患者血浆中显著高表达。在更大量人群样本中，通过进一步验证，我们证实了circPRMT5在结直肠癌患者血清中高表达，提示circPRMT5可能是结直肠肿瘤患者的临床标志物。结合人群的临床病理学特征，高表达circPRMT5提示了更差的临床预后，并且与预后不良的病理学指标相关。通过多因素COX回归分析，我们发现circPRMT5是提示患者不良预后的独立因素。

目前越来越多的研究显示circRNA是重要的非编码RNA分子，发挥了多种多样的生物学调控作用。不仅如此，circRNA特有的更加稳定的闭环结构，使其成为更加有潜力的临床标志物。目前已经有多项研究发现，血浆circRNA分子能够作为诊断疾病的分子标志物［7-9］。血浆circRNA0004904/0001855能够作为诊断孕妇子痫的、新的血浆分子标志物［10］；血浆中的circRNA还能作为判断糖尿病视网膜病变的分子标志物［11］。在肿瘤患者血浆中可以检测到circRNA分子的表达，这些研究还发现了circRNA分子是具有很强的临床诊断意义［12-13］。crcRNA0000285的表达水平与鼻咽癌患者的预后明显相关，同时也和鼻咽癌患者对放疗的敏感性密切相关［14］。circ0004018在肝癌组织中高表达，是肝细胞肝癌患者预后相关的重要分子标志物［15］。circPRMT5在前列腺癌患者血浆中高表达，能够促进前列腺癌细胞的上皮间质转化，促进前列腺癌的转移［16］。我们的研究发现在结直肠癌患者血浆中，circPRMT5显著高表达。更为重要的是，我们的研究发现了circPRMT5是重要的临床分子标志物。通过我们的分析发现了，circPRMT5的高表达组患者中，肿瘤分期更晚，淋巴结转移数目更多，提示预后不良的病理因素也更多。通过生存分析，我们还发现与低表达组患者相比，高表达circPRMT5的患者的总生存时间和无复发生存时间更短；经过单因素和多因素的COX回归分析，我们发现了circPRMT5的表达水平，是预测患者总生存和无复发生存的独立危险因素。由此，我们发现了circPRMT5是结直肠癌中重要的分子标志物。

综上所述，我们的研究发现circPRMT5在结直肠癌患者血浆中高表达，同时也是重要的临床分子标志物。circPRMT5与患者的肿瘤分期，淋巴结转移数目等相关病理学指标密切相关。高表达circPRMT5也不良预后的独立危险因素。我们的研究发现结直肠癌患者中新的血浆分子标志物，为结直肠癌患者早期诊断和预后判断方面带来新的思路。