缺氧诱导BCL9促进结肠癌细胞的增殖与迁移

臧佳 谢亚运 李新星 张言言 胡志前

绝大多数恶性肿瘤生长迅速，导致肿瘤内部处于相对缺血、缺氧的状态。在缺氧的条件下，缺氧诱导因子 1α（hipoxia induce factor 1α，HIF1α）亚基因降解受到抑制而在肿瘤细胞内部堆积［1-2］。大量堆积的HIF1α广泛启动下游基因的表达，改变细胞的能量代谢方式，诱导毛细血管生成，加速肿瘤细胞分裂、增殖［3-4］。

以往研究认为B-淋巴细胞瘤蛋白9（B-cell lymphoma 9，BCL9）是Wnt通路下游的转录协同因子，BCL9的表达能促进肝癌，胃癌，乳腺癌的发展［5-7］。在BCL9的启动区域，存在多个缺氧诱导反应元件（hipoxia response element，HRE），BCL9可能受到HIF1α调控表达，从而促进肿瘤进展。目前，BCL9在结肠癌中的研究尚未见详细报道，本研究拟探索HIF1α对BCL9的调控关系，并进一步探明BCL9对结肠癌细胞的恶性生物学作用。

材料与方法

一、一般资料

本研究中所有结肠癌标本及同一患者的正常结肠标本，皆来自2013年1月至2016年7月在上海长征医院接受了肿瘤切除手术的患者，并且术后病理确诊为结肠癌。所入选的病例均被告知研究内容，并取得患者本人或委托人的知情同意。收取的典型结肠癌及相应正常结肠组织立即放入液氮冻存或福尔马林固定。本研究中所使用的HCT116细胞购自美国ATCC公司，配制含10%胎牛血清、90%DMEM高糖培养基、1%双抗（链霉素、青霉素）的培养基培养细胞，低氧培养时设置氧浓度为4%。

二、实验方法

1.免疫组织化学检测BCL9：10%福尔马林固定标本；梯度乙醇脱水，石蜡包埋组织；切片机切片（4 μm）；60度烘烤切片20 min，二甲苯浸泡10 min（2次），无水乙醇浸泡5 min，梯度乙醇脱水，蒸馏水洗涤；使用抗原修复液修复抗原，3%双氧水阻断过氧化物；BCL9（1:3 000稀释；ab37305，Abcam），室温孵育1 h，PBS洗涤5 min，3次；孵育二抗，过程同前；使用DAB溶液显色7 min；苏木精复染，松节油封片，晾干；显微镜镜下观察、拍照。

2. RNA提取、逆转录及实时定量PCR：按常规方法抽提总RNA，使用TAKARA公司逆转录试剂盒逆转录。荧光实时定量PCR试剂购自Biotool公司，依说明书配制反应体系。设置反应程序为：初始95℃ 10 min；95 ℃ 30 s解链，58℃ 30 s退火，72℃ 10 s延伸，共40个循环；以GAPDH为内参，设三个复孔，取平均值。BCL9引物为，正向：5′-CAGCTGGATTCCAAATTCTC-3′， 反 向：5′-GAGTCGGCGGAAATACTTCG-3′；GAPDH 引物为，正向：5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向：5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′。

3. 蛋白印记法检测BCL9、HIF1α表达：裂解细胞收集蛋白；常规电泳、转膜；10%脱脂牛奶封闭，室温、摇床约2 h；TBST漂洗5 min；将PVDF膜放入抗体孵育盒中，加入用一抗体稀释液（抗 BCL9、HIF1α、Actin，购自美国Santa公司），摇床4℃过夜；摇床上用TBST缓冲液漂洗3次，每次10 min；加入辣根过氧化物酶标记的二抗（美国Santa），摇床室温孵育1 h；TBST漂洗3次，将ECL发光底物A、B按比例混合，适量覆盖PVDF膜，显影。

4. 荧光素酶活性检测：设计引物调取BCL9的启动子序列，5′-ACG CGT GCT AGC CCG GGC AGA TGG TCT CCG TCT CCT-3′；5′-AAC AGT ACC GGA ATG CCA GAC AAG CCA CAA ACA AGA C-3′；将启动子序列克隆至PGL3载体XhoIHindIII酶切位点之间，测序验证载体构建成功（PGL3-P-BCL9）；实验组转染PGL3-P-BCL9后予缺氧处理或合并转染HIF1α表达质粒（pcDNA3.1＋HIF1α，购自金维智公司），对照组转染PGL3-P-BCL9后予常氧培养或合并转染pcDNA3.1＋，48 h后裂解细胞，加荧光素试剂（购自Biotool公司），检测荧光值。

5. CCK8细胞活性及Transwell实验：以HCT116为靶细胞，转染siRNA或过表达质粒pcDNA3.1＋BCL9干 预BCL9的 表 达（siRNA序 列 为：CCUGAGGAGAUGCUGAAAUUAC），通过实时荧光定量PCR检测干预效率，将干预后的HCT116细胞以相同密度接种于96孔板中，于36 h检测吸光度；将干预后的HCT116细胞以相同密度接种于Transwell上室（武汉博士德生物技术有限公司），下室加入含10% FBS的培养基。培养24 h后结晶紫染色，拍照记录结果。

三、统计学分析

应用SPSS 20.0统计软件分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、结肠癌中BCL9表达升高

通过免疫组化技术，检测20例结肠癌及同一患者正常结肠组织中BCL9的表达。结果如图1A所示，肿瘤组织中BCL9表达量明显高于正常组织。图1B为实时荧光定量PCR检测肿瘤及正常组织中BCL9 RNA的表达量，肿瘤组织中BCL9 RNA的表达量明显高于瘤旁组织［（3.25±0.53）vs.（1.03±0.12），P＜0.05］，差异具有统计学意义。

图1 肿瘤组织与正常组织的免疫组化与实时荧光定量PCR。1A：免疫组织化疗结果显示，肿瘤组织的BCL9表达量明显高于正常组织（10倍镜与40倍镜下）；1B：实时荧光定量PCR检测发现BCL9 RNA的表达明显高于正常组织，P＜0.05，差异具有统计学意义

二、结肠癌中HIF1α调控BCL9表达

在BCL9启动区域存在3个HRE，其具体位置如图2A所示，HRE是HIF1α识别并结合靶基因的位点。通过缺氧或常氧培养HCT116细胞，于36 h后抽提总RNA进行实时荧光定量PCR检测，结果如图2B，缺氧与常氧组比较，［（6.71±0.83）vs.（1.54±0.21），P ＜ 0.05］，差异具有统计学意义；同时，我们抽提靶细胞蛋白，通过western-blot在蛋白水平验证BCL9的表达（图2C）。通过上述结果，我们发现缺氧诱导BCL9表达升高。为了进一步验证缺氧诱导BCL9表达是通过HIF1α所介导，我们构建了含BCL9启动子区域的荧光素酶报告载体PGL3-P-BCL9，并进行荧光素酶报告实验，结果显示如图2D-E所示，缺氧或过表达HIF1α后荧光素酶活性明显增强［（3.53±0.75）vs.（0.96±0.15），（4.83±0.62）vs.（1.02±0.14）；P＜0.05］。上述结果表明，缺氧诱导HIF1α激活BCL9的表达。

图2 HIF1α调控BCL9表达。2A：BCL9启动子区缺氧诱导原件（HER）的分布；2B：实时荧光定量PCR检测BCL9 RNA的表达；2C：western-blot检测BCL9、HIF1α的表达；2D、2E：荧光素酶活性检测。代表P＜0.05，差异具有统计学意义

三、BCL9促进结肠癌细胞增殖、迁移

以HCT116为靶细胞，通过siRNA或过表达质粒pcDNA3.1＋BCL9干预BCL9的表达，实时荧光定量PCR检测干预效率，结果如图3A所示。干扰BCL9表达后，HCT116细胞的增殖活性明显受到抑制［（1.23±0.12）vs.（1.87±0.15），P＜0.05］；过表达BCL9后，HCT116细胞的增殖活性明显增强［（2.43±0.16）vs.（1.81±0.14），P＜0.05］，结果如图3B所示。同时，干扰BCL9表达后，HCT116细胞的迁移能力明显受到抑制；而过表达BCL9促进了HCT116细胞迁移（图3C～D）。

图3 BCL9对结肠癌细胞增殖和迁移能力的影响。3A：实时荧光定量PCR检测BCL9干预效率；3B：CCK8实验检测干预BCL9后HCT116的增殖活性；3C、3D：Transwell实验检测干预BCL9后HCT116的增殖活性。代表P＜0.05，差异具有统计学意义

讨 论

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，发病率占胃肠道肿瘤的第三位，其发病年龄基本在40岁以上，高发于50～60岁之间，男女比例为2～3:1。近年来，结肠癌的发病率与病死率呈上升趋势，全世界每年大约有120万新增病例。尽管近年来外科手术和化疗方面取得了长足的进展，患者的5年生存率至今仍徘徊在50%左右，多数患者最终仍然死于结肠癌的局部复发或远处转移［8］。了解结肠癌恶性生物学行为的分子机制，探索精准、有效的治疗方法已成为国内外研究该疾病的焦点。

人源BCL9首先在B细胞急性淋巴母细胞白血病（ALL）患者中发现，属于条件细胞核相关蛋白并可穿梭于细胞核内外，在与核内的转录辅因子Pygo结合后则分布于核内［9］。有研究表明，BCL9在Wnt信号通路中作为衔接蛋白与β-catenin、TCF/LEF和Pygopus结合，形成TCF/LEF-βcatenin-BCL9-PYGO四聚体核复合物，从而参与激活经典Wnt信号通路下游靶基因的转录，促进肿瘤细胞增殖、转移以及肿瘤组织血管生成［10-11］。BCL-9在多中恶性肿瘤组织中表达上调，如多发性骨髓瘤、肝细胞癌、胃癌、乳腺癌及肺腺癌组织等表达上调，并促进肿瘤细胞的增殖［5-7］。关于BCL9在结肠癌中的研究尚未见到详细报道，我们通过免疫组化及实时荧光定量PCR检测20例结肠癌组织及相应的正常结肠组织，发现结肠癌中BCL9表达明显增高。

由于恶性肿瘤生长迅速，肿瘤内部微环境常处于相对缺氧的状态，造成HIF1α在细胞内堆积，并与HIF1β形成稳定的二聚体进入细胞核，激活大量下游基因的表达，调整细胞适应缺氧环境［12-13］。HIF1α特异性地识别并结合HRE（G/ACGTG），从而激活靶基因的转录［14］，在BCL-9启动子区域存在多个HRE，我们认为结肠癌中BCL9的高表达可能由HIF1α激活所致。我们以HCT116细胞为靶细胞，给予缺氧处理后发现BCL9及HIF1α的表达在RNA水平及蛋白水平中显著提高。为了进一步验证HIF1α对BCL9的调控关系，我们构建了含有BCL9启动子序列的荧光素酶报告载体，通过合并转染对照和过表达HIF1α质粒，发现过表达HIF1α后荧光素酶活性明显增强，这进一步证明了HIF1α对BCL9的调控关系。随后，为了探索异常表达的BCL9对结肠癌的生物学作用，我们通过siRNA和过表达质粒干预HCT116细胞中BCL9的表达，结果表明干扰BCL9的表达可以抑制HCT116细胞的增殖及迁移能力，增强BCL9的表达可以促进HCT116细胞的增殖及迁移能力。

本研究表明，缺氧诱导BCL9在结肠癌组织中高表达，并且BCL9高表达可以促进结肠癌细胞的增殖及迁移，为研究结肠癌恶性生物学行为的分子机制提供了新的理论借鉴。同时，由于BCL9又是Wnt信号通路上的重要的转录协同因子，这表明缺氧信号通路可能通过BCL9参与Wnt信号通路的调控，为信号通路的网络关系研究提供新的思路。