响应面法优化超声辅助提取酸枣仁异牡荆素工艺

杨婷婷,李佳怡,张彦青,2,*,解军波,2,王 轻,2

(1.天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津 300134;2.天津市食品生物技术重点实验室,天津 300134)

酸枣仁是鼠李科植物酸枣(ZiziphousjujubaMill. Var.Spinosa(Bunge)Hu. Et H.f. Chou)的干燥成熟种子,具有镇静安眠、补肝宁心等功效[1],黄酮类化合物是其主要化学成分[2-3]。大量研究证明,异牡荆素是具有较强抗氧化活性的黄酮类化合物[4],可通过缓解细胞氧化应激来减轻过氧化氢诱导的细胞损伤[5]。

目前,酸枣仁异牡荆素的主要提取方法有浸提法和乙醇加热回流法[6],但是浸提法提取时间太长,而乙醇加热回流法设置温度太高。近年来,超声提取技术因利用空化、机械和热效应的优势被广泛用于提取化合物,具有得率高、提取时间短的优点,从而提高工作效率[7-8]。目前,超声辅助提取技术被广泛用于提取中药化学成分[9-10],展现出良好的应用前景。近几年,关于植物中异牡荆素提取的研究较多且得率都比较低[11-12],同时,关于超声技术用于优化酸枣仁黄酮化合物异牡荆素提取方面的研究报道尚少。

本研究在单因素实验的基础上,结合响应面优化试验对影响异牡荆素得率的主要因素及其交互作用进行分析探讨,优化超声辅助提取技术的最佳提取工艺参数,以期建立一种实用有效的异牡荆素提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸枣仁 天津蓟县;异牡荆素对照品 实验室自制,纯度>98%;乙腈、冰醋酸、无水乙醇、石油醚 天津市鑫桥化工有限公司;去离子水 实验室自制。

SB25-12 DTD型数控超声波清洗器 宁波新芝生物科技有限公司;V-700型旋转蒸发仪 瑞士Buchi公司;LG10-2.4A型高速离心机 北京医用离心机厂;DH-101型电热恒温鼓风干燥箱 天津中环实验电炉有限公司;FA1004Max 100 g型电子天平 上海精科天平有限公司;ALPHA 1-2LD PLUS型真空冷冻干燥机 德国Marin Christ公司;FW100型高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司;Agilent 1100型高效液相色谱仪、Agilent1100色谱工作站、二极管阵列检测器 安捷伦科技中国有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酸枣仁脱脂 酸枣仁50 ℃干燥24 h后粉碎至60目,以液固比3∶1 (mL/g)加入石油醚,加热回流脱脂两次,第一次70 ℃加热回流3 h,第二次70 ℃加热回流2 h[13]。静置冷却,利用旋转蒸发器在55 ℃下减压回收石油醚,合并脱脂粉末于通风厨,挥干后常温放置备用。

1.2.2 超声辅助提取工艺 精密称定脱脂酸枣粉末5.00 g于具塞三角瓶中,以一定料液比加入乙醇,然后放置在已达到一定实验温度的数控超声波清洗器中,在一定功率下超声一定时间,开始超声提取。超声停止后,离心过滤得异牡荆素提取物,测定异牡荆素得率。

1.2.3 单因素实验 大量研究证明,影响异牡荆素得率的主要因素有超声时间、超声功率、乙醇体积分数和液固比[14-17]。固定提取因素的条件:超声时间50 min,乙醇体积分数60%,超声功率300 W,液固比15∶1 mL/g,在其他条件不变的情况下,改变其中一个因素考察其对异牡荆素得率的影响。超声功率考察水平有100、200、300、400、500 W,超声时间考察水平有30、40、50、60、70 min,液固比考察水平有5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 mL/g,乙醇体积分数考察水平有40%、50%、60%、70%、80%。

1.2.4 响应面优化试验[18]在单因素实验的基础上,筛选出了超声功率、液固比、超声时间、乙醇体积分数四个影响因素的水平,以这四个因素为自变量,异牡荆素得率(Y)为响应值,设计响应面试验因素水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平设计Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 异牡荆素得率的测定

1.2.5.1 高效液相色谱条件 色谱条件:ODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-水(千分之一醋酸)=18∶72 (V/V);体积流量:0.5 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:10 μL,检测波长:335 nm[11]。

1.2.5.2 标准曲线的制作 为得到异牡荆素标准曲线,精密称取异牡荆素对照品50.0 mg,用18%乙腈溶解,定容于50 mL容量瓶中,分别精密吸取标准品溶液0.5、1.0、1.5、2、2.5、3 mL于10 mL量瓶中,18%乙腈定容,摇匀即配制浓度为50、100、150、200、250、300 μg/mL对照品溶液,HPLC法(安捷伦1200系列高效液相色谱系统)检测得峰面积。以标准品浓度C为横坐标,峰面积(A)为纵坐标,得到异牡荆素标准曲线为A=1.3901C+3.98,R2=0.9993,具有良好的线性关系。

1.2.5.3 异牡荆素得率的计算 所有提取样品经0.45 μm微膜过滤,进行HPLC检测,将峰面积代入异牡荆素标准曲线,计算得到对应浓度C,再将C带入下式计算得异牡荆素得率。Y异牡荆素得率(%)=(CV×稀释倍数)/m×100,其中V是提取液的体积,m是脱脂后原料干重。

1.3 数据处理

数据处理软件GraphPad Prism 5TM和SPSS,绘图软件GraphPad Prism 5TM,响应面数据分析软件Design-Expert,每组实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声功率对酸枣仁异牡荆素得率的影响 超声功率对酸枣仁异牡荆素得率的影响如图1。由图可知,异牡荆素得率随着超声功率的升高呈现先增高再降低的趋势,在400 W时得率达到最大值0.202%,随后超声功率继续增加,破坏了异牡荆素的稳定性,导致溶出的异牡荆素大量降解,因此得率降低,超声功率500 W时,得率仅为0.151%。因此选择超声功率300、400和500 W三个水平进行响应面优化试验。

图1 超声功率对异牡荆素得率的影响

2.1.2 超声时间对酸枣仁异牡荆素得率的影响 超声时间对酸枣仁异牡荆素得率的影响(图2)表明,随着时间的延长,异牡荆素得率呈现先升高后降低的趋势,50 min得率为0.170%,在60 min时出现最大值0.228%,超过60 min后,超声时间过长,异牡荆素被降解,因此得率呈现悬崖式下降,超声持续到70 min得率仅为0.115%。因此,选择超声时间为50、60和70 min进行响应面优化试验。

图2 超声时间对异牡荆素得率的影响

2.1.3 液固比对酸枣仁异牡荆素得率的影响 超声功率对酸枣仁异牡荆素得率的影响如图3。由图3可知,异牡荆素得率随着液料比的增加呈先增大后降低的趋势,液固比为5∶1 mL/g时,得率为0.106%,液固比15∶1 mL/g的得率最大,为0.195%,在液料比为15∶1～25∶1 mL/g 处,异牡荆素几乎已全部溶出,过高的溶剂体积使溶出的异牡荆素被不断稀释,从而导致得率缓慢下降到25∶1 mL/g的0.187%。考虑到节约原料,选择液固比为10∶1、15∶1和20∶1 mL/g 进行响应面优化试验。

图3 液固比对异牡荆素得率的影响

2.1.4 乙醇体积分数对酸枣仁异牡荆素得率的影响 从图4可以看出,乙醇体积分数对异牡荆素得率的影响比较大,40%乙醇处异牡荆素得率为0.146%,随着乙醇体积分数的增加,异牡荆素得率逐渐增大,在70%处,得率急速增到0.231%又急速降低,过高的乙醇浓度会破坏黄酮的化学结构,导致异牡荆素分解,从而导致得率降低,在乙醇体积分数为80%时得率仅为0.142%。因此,选择乙醇体积分数60%、70%和80%三水平进行响应面优化试验。

图4 乙醇体积分数对异牡荆素得率的影响

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 响应面试验设计及结果 根据表2中的因素与水平值,建立四因素三水平响应面试验优化提取工艺,结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.2 回归方程拟合及方差分析 Design-Expert 8.0.6软件对表3中的数据进行分析,拟合出的二次多项回归方程为:

表3 回归模型的方差分析结果Table 3 The results of variance analysis of the regression model

Y=0.23+5.5×10-3A+8.25×10-3B+0.012C+0.012D-5×10-4AB-2×10-3AC+2.5×10-3AD+4.5×10-3BC+3.25×10-3BD+4×10-3CD-0.033A2-0.018B2-0.019C2-0.018D2。

该模型的拟合程度达极显著水平(p<0.0001),说明模型有意义。失拟项不显著(p=0.288),表明该模型拟合程度良好,与试验值的误差相对较小。模型决定系数(R2=0.9755)较高,可以用回归方程代替试验真实点,对结果进行分析和预测[19-20]。此外模型变异系数(CV)=2.60%,表明该试验值精密可靠,可以用于统计学分析。A(超声功率)、B(液固比)、C(超声时间)和D(乙醇体积分数)对异牡荆素得率都有极显著影响(p<0.01),二次项A2、B2、C2和D2达到极显著水平(p<0.01)。各因素的影响重要性依次为:乙醇体积分数>超声时间>液固比>超声功率。

2.2.3 交互作用分析 通过用Design-expert V8.0.6软件设计三维响应面来反映最佳区域,固定两个影响因素为中值,代入模型方程考察其余两个因素间的相互作用[21],根据方程做出三维响应面图和等高线图,通过判断三维图的坡度和等高图的圆形程度,从中选取得率最佳的提取条件[22],结果见图5。

图5 两两因素交互作用对异牡荆素得率影响的响应面图

根据响应面试验的设计原理分析图5可知,六组三维图的弯曲度都比较大,说明随着超声功率、超声时间、液固比和乙醇体积分数等因素水平的变化,异牡荆素提取效果也呈现显著性地先升高再逐渐减小的变化趋势,但两两因素间交互作用对响应值没有显著的影响(p>0.05)。

2.2.4 验证实验 由响应面软件得到的最佳提取工艺条件为:超声功率为419.00 W,液固比15.5∶1 mL/g,超声时间60.20 min和乙醇体积分数73.7%。预测最佳目标值为0.236%。根据实验操作的具体情况,改进最佳提取条件为:超声功率419 W,液固比16∶1 mL/g,超声时间61 min,乙醇体积分数73.70%。测得异牡荆素得率的实际值为0.241%±0.0126%,与预测得率的0.236%相对误差为2.075%,且t检验的结果差异不显著(p>0.05),证明模型理论预测值与实际值拟合效果良好。

3 结论

本研究采用超声辅助法提取酸枣仁中的异牡荆素,利用响应面法优化提取工艺条件。单因素实验结果表明,超声功率、液固比、超声时间和乙醇体积分数对异牡荆素得率的影响作用都比较明显。在单因素实验基础上,建立四因素三水平的Box-Behnken响应面试验方法对异牡荆素提取工艺进行优化以及验证。结果表明各因素对异牡荆素得率的影响大小顺序为:乙醇体积分数>超声时间>液固比>超声功率。优化提取工艺条件为:超声功率419 W,液固比16∶1 (mL/g),超声时间61 min,乙醇体积分数73.70%。实际得率为0.241%±0.0126%,与模型预测值0.236%相符良好。因此,本试验建立的二次多项回归方程模型能够良好地预测各因素与响应面之间的变化关系。