朝鲜族大酱中异黄酮的提取工艺优化及其抗肿瘤活性研究

齐 欣,张 露,齐仕博,宋鑫萍,崔承弼

(延边大学农学院,吉林延吉 133000)

朝鲜族大酱是朝鲜族特色食品之一,是由大豆经微生物(如米曲霉、毛霉等)发酵而得的一种发酵制品,因其具有独特的风味及营养价值[1],被越来越多的大众接受,近年来对朝鲜族大酱的研究也越来越多。

研究显示,大豆发酵产品的总酚、异黄酮含量均高于未发酵大豆,且随着发酵的进行,其中的活性成分也有所变化。朝鲜族大酱中具有多种对人体有益的营养成分[2],其主要功能成分为大豆异黄酮,其具有防治癌症、抗氧化和改善妇女更年期综合症等多种生理功能[3]。据Messina报告,欧美国家患乳腺癌、大肠癌的几率远远高出中国和日本等经常食用豆类食品的国家,据调查统计,在亚洲,每人每天所吸收的大豆异黄酮含量约为40 mg,而美国和欧洲的吸收量则远远小于40 mg,仅为3 mg左右[4-5],由此可见,经常食用豆类制品与降低癌症的发生率有明显的相关性,摄入足够的大豆类食物可大大降低女性患乳腺肿瘤疾病的风险[6]。近年来,许多研究人员为了揭示大豆摄取量是否与癌症的发病率有关,对癌症发病率进行了调查,调查结果表明患病率极高的几种癌症,如:乳腺癌、肺癌、前列腺癌以及胃癌等疾病的发病率都与豆类食物的摄取量呈现一定的负相关性,由此认为通过摄入大豆异黄酮可以在一定程度上有效地预防和缓解癌症产生的风险。在有关朝鲜族大酱的研究中,已证明其具有抗突变性[7]。为研究其在乳腺癌细胞增殖方面的作用,对其进行了本次试验研究。

目前大豆异黄酮的提取方法主要有溶剂萃取法,超声波萃取法,微波萃取法和超临界流体萃取法,而溶剂萃取法和超声波萃取法的使用较为广泛[8],但仍存在有机溶剂不能高效利用、提取率达不到最佳水平等诸多问题,为能最大程度地利用所选有机溶剂,提高朝鲜族大酱中大豆异黄酮的提取率,本文对超声波提取异黄酮的工艺进行了优化,并检测了朝鲜族大酱中异黄酮对乳腺癌细胞的增殖抑制作用以及对凋亡相关蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

朝鲜族大酱 实验室自制[9];MDA-MB-231、MCF-10A正常乳腺细胞 韩国PSA公司;MCF-7 吉林大学。

无水乙醇 科密欧有限公司;DMEM、胎牛血清 美国Gibco公司;青-链霉素、胰酶、PBS 索莱宝公司;总蛋白定量(BCA)测定试剂盒 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;caspase-3抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、β-actin抗体 Abcam(上海)贸易有限公司;CCK-8 碧云天生物有限公司。

HH-6数显恒温水浴锅 金坛市科析仪器有限公司;TG16A-WS离心机 上海卢湘仪器有限公司;FA2004分析天平 上海上平仪器有限公司;SP-Max3500FL型多功能荧光酶标仪 上海闪谱生物科技有限公司;KQ3200DE超声波仪 昆山市超声仪器有限公司;EYELA OSB-2100旋转蒸发仪 日本东京理化有限公司;Micro21低温超速离心机 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;伯乐电泳仪、伯乐510凝胶成像系统 美国UVP公司。

1.2 试验方法

1.2.1 朝鲜族大酱异黄酮的提取工艺 称取10 g烘干后的大酱粉,加入一定体积乙醇溶液,于一定温度水浴锅中保温浸提一定时间后,以4000 r/min 的转速离心5 min,取上清液测定大豆异黄酮含量。

1.2.2 单因素实验 分别考察提取时间、温度、料液比对朝鲜族大酱异黄酮得率的影响。在温度为50 ℃、料液比为1∶24时,分别超声提取40、60、80、100、120 min,研究超声时间对朝鲜族大酱中异黄酮得率的影响;以料液比为1∶24,30、40、50、60、70 ℃下提取80 min[10],研究提取温度对朝鲜族大酱中异黄酮得率的影响;在温度为50 ℃时,料液比分别为1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24超声提取80 min,研究料液比对朝鲜族大酱中异黄酮得率的影响。

1.2.3 正交试验 以提取时间、提取温度、料液比为试验因素,设计三因素三水平的正交试验,如表1所示。用体积分数75%的乙醇作溶剂,考核指标为异黄酮得率,进行正交试验,选出最优组合。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

1.2.4 提取物中异黄酮得率的测定 参考Jia等[11]方法并略有改动。取大酱异黄酮提取液2.0 mL,加40%乙醇3 mL。依次加5% NaNO2溶液0.3 mL、10%硝酸铝溶液0.3 mL,新试剂加入前都需摇匀并静置6 min。再加入1 mol/L NaOH溶液4 mL,用40%乙醇0.4 mL,混合均匀后静置15 min。在510 nm处测量上述步骤中获得的混合液的吸光度。以芦丁为标品作标准曲线,样品中的异黄酮含量以芦丁计。异黄酮得率(%)以单位质量大酱粉中提取的异黄酮质量表示,计算公式如公式(1)所示:

式(1)

1.2.5 异黄酮溶液的配制 朝鲜族大酱异黄酮按正交试验的最优工艺参数进行提取,提取后冻干成粉,并按1.2.4方法测定粉末中异黄酮的质量分数。称取10 mg提取物粉末,溶于0.1 mL二甲基亚砜(DMSO)中,加入9.9 mL含血清培养基,制得母液浓度为1000 ng/mL,依次稀释为400、200、100、50、25 ng/mL的药液,4 ℃保存备用。

1.2.6 CCK-8法检测朝鲜族大酱提取物对乳腺癌细胞的增殖情况 取对数生长期的MCF-7和MDA-MB-231以及正常乳腺细胞,PBS洗涤三次,加入胰酶进行消化,再加入等体积含血清培养基终止消化,移液枪吹打,转入15 mL离心管中,1000 r/min离心5 min,离心后弃上清,加入1 mL新鲜培养基重悬,吸取5 μL于细胞计数板中,进行计数,将细胞稀释成浓度为5×104个/mL的细胞悬液,向96孔板中加入100 μL细胞悬液,相当于每孔接种5000个细胞,放于37 ℃含5% CO2的培养箱中过夜,使细胞贴壁。次日向各孔中加入不同浓度的药液(25、50、100、200、400 ng/mL)10 μL,于37 ℃含5% CO2培养箱中分别孵育24、48、72 h,孵育后去除培养基,用培养基洗涤细胞两次,加入100 μL新鲜培养基,各孔再加入10 μL CCK-8,37 ℃孵育,分别在0.5、1、2、4 h测定在450 nm处的OD值。细胞活力计算公式如公式(2):

式(2)

式中:A1-加药组,细胞、药物和CCK-8;A2-不加药组,只加细胞和CCK-8;A0-空白,只加培养基和CCK-8。

1.2.7 异黄酮处理后对乳腺癌细胞凋亡相关蛋白表达量的影响

1.2.7.1 Western Blot试剂准备 10×电泳缓冲液:称取甘氨酸144.0 g、Tris-base 20.3 g、SDS 10.0 g,用三蒸水定容至1000 mL;10×转膜缓冲液:称取甘氨酸144.0 g、Tris-base 30.3 g,用三蒸水定容至1000 mL;20%甲醇:100 mL甲醇于容量瓶中,三蒸水定容至500 mL;1×电泳液:称取已配好的10×电泳缓冲液50 mL,三蒸水定容至500 mL;1×转膜液:称取已配好的10×转膜缓冲液50 mL,100 mL 20%甲醇,用三蒸水定容至500 mL;TBST:20×TBS 50 mL,1 mL吐温-20,用三蒸水定容至1000 mL;5%封闭液:称取脱脂奶粉1 g,用20 mL TBST进行溶解,在摇床上摇匀待用;抗体:参考说明书和预实验决定稀释比例,用TBST进行稀释。

1.2.7.2 Western Blot样品蛋白提取 取传代后处于对数生长期的细胞,待铺满瓶底70%～80%时加入400、100、25 ng/mL大豆异黄酮提取物,于37 ℃,5% CO2培养箱中培养48 h,取出后用胰酶进行消化,1000 r/min离心5 min,弃上清,每管加入100 μL裂解液吹打,转移到1.5 mL EP管中,4 ℃、12000×g离心30 min,取上清于1.5 mL EP管中,只取清液,宁少勿多。

1.2.7.3 Western Blot蛋白含量测定 按照赛默飞世尔BCA蛋白含量检测试剂盒说明进行操作,标准品及样品于96孔板进酶标仪测定,以标准品浓度为横坐标,吸光度为纵坐标做标准曲线,求样品浓度,按30 μg上样量计算上样体积,剩余蛋白以4∶1加入5×蛋白上样缓冲液放入沸水煮5 min,分装后放入-20 ℃保存备用。

1.2.7.4 Western Blot电泳 按照SDS-PAGE凝胶制备试剂盒配制12%分离胶以无水乙醇压平液面,30 min后配制5%浓缩胶插入上样梳,分离胶和浓缩胶的配制如表2。

表2 分离胶和浓缩胶的配制Table 2 Preparation of separation gel and concentrated gel

待浓缩胶都凝固后,以100 V恒压,电泳120 min,随后100 V转膜60 min,转膜结束后,将PVDF膜在5%脱脂奶粉中封闭1 h,相应条带以相应一抗用TBST按比例稀释后孵育,4 ℃过夜,二抗孵育2 h,用ECL显色放入凝胶成像系统显影并拍照。

1.3 统计分析

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 大酱中异黄酮提取率随提取时间的变化 由图1可见,提取时间40～80 min时,提取率趋势为缓慢上升,80～100 min时开始下降,100～120 min缓慢上升。可能由于提取时间过短时,异黄酮并未完全溶到有机溶剂中,但随着时间的延长,高温可能导致异黄酮结构受到了破坏,从而提取率下降,因此,提取时间为80 min时朝鲜族大酱中异黄酮提取率最高。

图1 提取时间对提取率的影响

2.1.2 大酱中异黄酮提取率随提取温度的变化 由图2可见,提取率的整体变化趋势为随着温度的升高,先上升后下降,温度较高时,可能导致活性物质分解,在温度为50 ℃时提取率达到最大值0.819%。因此,朝鲜族大酱中异黄酮的最佳提取温度为50 ℃。

图2 提取温度对提取率的影响

2.1.3 大酱中异黄酮提取率随料液比的变化 如图3可见,提取率随着溶剂用量的增多而升高,但料液比达到1∶20后,异黄酮的提取率趋于稳定,说明异黄酮的溶出已达平衡。但料液比为1∶24时的提取率略高于料液比为1∶20时的提取率,考虑到实验的可操作性以及节约药品,提取时选择1∶8、1∶16、1∶24的料液比进行正交试验。

图3 料液比对提取率的影响

2.2 正交试验结果

在单因素实验的基础上,按照正交表L9(34)的因素水平组合进行正交试验,选用体积分数为75%的乙醇作溶剂,考察大酱中异黄酮的提取率,所得结果如表3所示。极差分析表明,对大酱中异黄酮提取率的影响最大的是料液比,其次是提取时间,最后为提取温度。最佳条件组合是A2B2C3,即提取时间为80 min、料液比为1∶24、温度50 ℃时提取率最佳,为0.802%。测得芦丁的标准曲线为y=0.699x+0.036,R2=1,按最优条件提取的冻干后的粉末中总异黄酮含量为(8.00±0.03) mg/g,质量分数为0.8%。

表3 正交实验设计与结果Table 3 Orthogonal experimental design and results

2.3 CCK-8法检测朝鲜族大酱提取物对乳腺癌细胞的增殖抑制作用

为探究朝鲜族大酱提取物对乳腺癌细胞增殖的影响,在药物处理后,通过CCK-8法检测其对细胞的增殖抑制作用。结果如图4所示,在24 h时,浓度为400、200、100、50、25 ng/mL的药物处理后,MDA-MB-231细胞的活力为25.12%、46.67%、60.53%、84.55%、106.97%,MCF-7细胞的活力为18.07%、27.07%、51.54%、68.53%、99.58%,抑制率随着药物浓度的增加呈现上升趋势,两种细胞活力和抑制率在不同浓度药物作用下均有显著性差异(p<0.05),在48 h时,不同浓度的药物处理后,MDA-MB-231细胞的活力为15.28%、17.29%、42.65%、77.76%、89.03%,MCF-7细胞的活力为15.33%、22.73%、43.73%、62.66%、87.73%,抑制率逐渐上升,在不同浓度药物作用下,细胞活力及抑制率均有显著性差异(p<0.05),在72 h时,不同浓度的药物处理后,MDA-MB-231细胞的活力为14.28%、19.91%、30.23%、33.36%、44.48%,MCF-7的细胞活力为5.41%、13.58%、25.05%、32.97%、44.38%,抑制率呈上升趋势,两种细胞随着药物浓度的递增,细胞活力和抑制率均有显著性差异(p<0.05)。而正常乳腺细胞MCF-10A中,除400 ng/mL处理72 h外，不同浓度药物作用均无显著性差异(p>0.05),且细胞活力在药物作用24、48 h后均在90%以上,在作用72 h后细胞活力均在80%以上,已知细胞活力在90%以上为无细胞毒性,细胞活力在80%～90%为亚毒性,可见朝鲜族大酱提取物在作用24、48 h时各浓度对正常乳腺细胞无毒性,根据以上数据确定后续试验中使用的高、中、低剂量浓度分别为400、100、25 ng/mL,作用时间选定48 h,通过以上数据可以看出,随着药物浓度的增加,细胞活力越来越低,抑制率越来越高,随着作用时间的延长,抑制率显示出增加的趋势,由此可见朝鲜族大酱提取物以剂量和时间依赖性的方式抑制乳腺癌细胞增殖。

2.4 药物处理后对乳腺癌细胞凋亡相关蛋白表达量的影响

图5(A)朝鲜族大酱异黄酮为MCF-7和MDA-MB-231两种乳腺癌细胞经低、中、高浓度药物处理48 h后Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达情况,图5中(B)、(C)为经ImageJ分析的条带量化图,结果显示,药物处理组中促凋亡蛋白Bax、caspase-3的表达量与空白对照组相比均显著上升(p<0.05),而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量明显下降,且呈现剂量依赖性。

图5 药物处理后乳腺癌细胞中凋亡相关蛋白表达量的变化

3 讨论

目前国内外对异黄酮的提取方法主要有以下几种,溶剂萃取法[12]、微波辅助萃取法[13-15]、超声辅助提取法[16-19]、超临界流体萃取法[20]以及高压浸提法[21]和连续逆流法[22-23]。超声波提取与传统工艺加热回流提取相比,具有省时、节约溶剂、提取率高的优点,在谢明杰等[24]人的研究中,通过对加热回流和超声波法的比较发现,超声波提取方法明显优于加热回流法,利用超声提取30 min所得大豆异黄酮的得率为0.452%,加热回流提取120 min的得率为0.310%,加热回流提取2次合计提取240 min的大豆异黄酮得率为0.451%。本实验中通过单因素和正交试验,对超声波提取朝鲜族大酱中的大豆异黄酮进行了提取优化,最终异黄酮得率为0.802%,进一步提高了其提取率,使原料和溶剂能够达到充分的利用。

现有研究已表明异黄酮具有抗癌的功效,其对肺癌、乳腺癌、肝癌等均能起到抑制肿瘤细胞生长,促进其凋亡的作用。有学者[25]研究了6328个病例中患有乳腺癌的几率,从统计结果中发现常常从食物中摄取大豆异黄酮的人患有乳腺癌的几率与不摄取或偶尔摄取的人相比有明显的差异,不摄取或偶尔摄取大豆异黄酮的人患病的几率远远高于经常摄食的人,这就说明了大豆异黄酮能够有效地降低恶性乳腺肿瘤的患病几率。胡建伟等[26]人研究了大豆异黄酮对大鼠乳腺癌发病率的影响,结果显示大豆异黄酮能够显著地降低乳腺癌发病率。这与本试验中大豆异黄酮能够抑制乳腺癌细胞增殖的结果相吻合。韦立群等[27]人的研究指出染料木素对细胞的抑制率呈现一定的剂量和时间依赖性,在染料木素作用后,能够呈浓度依赖性上调Bax、Caspase-3蛋白的表达,下调Bcl-2蛋白的表达,本实验当中,cck-8法检测后发现朝鲜族大酱异黄酮能够抑制乳腺癌细胞的增殖,对正常乳腺细胞无毒副作用,Bax和caspase-3的表达量在其作用后均有提升,Bcl-2的表达量有所下降,这与韦立群等人的研究结果一致,可见朝鲜族大酱异黄酮在对乳腺癌细胞的增殖和凋亡上起到了一定的作用。

4 结论

通过单因素实验和正交试验得出,对大酱中异黄酮提取率的影响最大的是料液比,其次是提取时间,最后为提取温度。最佳提取条件为:提取时间80 min、料液比1∶24、温度50 ℃,此时得率为0.802%。通过CCK-8实验可看出,朝鲜族大酱异黄酮对正常乳腺细胞无毒副作用,对MCF-7和MDA-MB-231两种乳腺癌细胞有抑制作用,且有剂量依赖性。经朝鲜族大酱异黄酮处理后的两种乳腺癌细胞当中,与凋亡相关蛋白的表达量均有所变化,其中促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达量随着药物剂量的增加而升高,而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达量则随着药物剂量的增加而降低,由此可见,朝鲜族大酱中的异黄酮可以在一定程度上抑制乳腺癌细胞的增殖,并影响凋亡相关蛋白的表达,其对乳腺癌细胞的生长能够起到抑制作用。