液态配方乳储藏过程中物理性质变化的研究

冯晓涵,庄柯瑾,田 芳,毛颖异,陈 磊,赵艳荣,关 岩,*,姜毓君,*

(1.东北农业大学食品学院 乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030;2.雅培营养品上海研发中心,上海 200233)

牛奶因营养含量丰富,备受公众青睐。随着人们生活水平的提高及乳制品行业的快速发展,消费者对乳制品的品质要求有所提高[1]。液态配方乳是以乳类为主要原料,适量加入维生素、矿物质、多不饱和脂肪酸(如二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳四烯酸(AA)等)等成分制成的乳制品,从而满足不同人群对营养的需求。

经超高温灭菌处理的乳制品在室温储藏时的保质期可达6～12个月,在无需冷藏的条件下也可进行储藏和运输[2]。但是,在长期储藏过程中易受到环境因素的影响诱发一系列物理、化学反应,使产品品质发生改变。除化学反应外,液态乳中物理性状的改变对其品质和货架期起到至关重要的作用,这些变化主要包括颜色变化、脂肪上浮、蛋白质沉淀和凝胶[3]。储藏过程中美拉德反应的发生会导致产品颜色的变化,脂肪球的聚集促进脂肪向上移动浮于顶部[4]。沉淀和凝胶形成主要涉及乳中蛋白质的聚集,当强度足够大时,就会在容器底部生成沉淀,在一定条件下会转化成凝胶,因此,蛋白质分子的聚集是凝胶产生的第一个阶段[4],同时也会使产品粒径增大。凝胶的形成主要有两个基本理论,一是酪蛋白被蛋白酶作用后发生分子重排,二是非酶作用,即物理化学变化后的蛋白质分子重排[5]。通常黏度在短时间快速升高,意味着将形成凝胶。

Richards等[6]研究低脂UHT乳在常温下储藏120～270 d的稳定性,发现pH轻微下降,色差显著增加。Malmgren等[5]评价UHT乳在5、22、30、40 ℃下储藏六个月后的物理稳定性,结果显示所有温度下UHT乳都出现颗粒聚集和蛋白质下沉现象。付莉等[7]研究发现液态配方乳在4～6 ℃储藏时稳定性较好。郭奇慧等[8]将UHT乳储藏在25、40 ℃下,应用脂肪粒径预测UHT乳货架期。如上所述,国内外已有UHT乳储藏稳定性和货架期预测的相关研究,但是针对液态配方乳的研究还相对较少,对其在不同储藏条件下各物理性状变化全面系统的研究则更少。并且在已有研究中,用于货架期预测的指标并非筛选得到,而是研究者选定的某个指标。

本研究将液态配方乳置于不同储藏温度下定期检测,研究长期储藏过程中各项物理指标变化规律及储藏温度对其变化的影响,初步探讨产生变化的原因,筛选具备货架期预测潜力的指标。本研究旨在分析液态配方乳储藏期内物理品质变化,为产品储运条件的选择、货架期预测模型的建立提供初步参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

液态配方乳 雅培营养品上海研发中心中试样品;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氨水、无水乙醇、石油醚、无水乙醚、浓硫酸、H2O2、0.1 mol/L盐酸、硼酸、氢氧化钠、95%乙醇、甲基红、溴甲酚绿 国药集团化学试剂有限公司;凯氏定氮消化片 丹麦福斯分析仪器公司;硝酸(超纯)、30%双氧水 美国J.T.Baker公司;甲醇 美国Fisher公司;质谱调谐液(1 μg/L) 安捷伦科技有限公司;元素标准溶液(钙、镁、铁、锌、磷混合标准品)、锗标准内标溶液 o2si标准品公司。

Fisher Scientific AB150 pH计、烘箱 赛默飞世尔科技公司;Zetasizer Nano ZS纳米粒度电位仪 马尔文仪器有限公司;DV2T粘度测定仪 美国博勒飞公司;ColorFlex EZ色差仪 美国HunterLab颜色管理公司;MS304S电子天平 梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司;WNB29水浴锅 德国美墨尔特公司;PLC-RZ6毛氏离心机 北京朋利驰科技有限公司;ER-35S数显恒温电加热板 上海慧泰仪器制造有限公司;凯氏定氮消化炉、Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪 丹麦福斯分析仪器公司;7900 ICP-MS 安捷伦科技有限公司;MARS 6微波消解炉 美国CEM公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计 液态配方乳采用超高温瞬时灭菌(140 ℃,5 s)工艺制备,制得样品主要组成包括各宏量营养素,及维生素(维生素A、维生素E、维生素C等)、矿物质(钙、磷、镁、铁、锌等)、多不饱和脂肪酸(DHA)等微量营养素。其中各宏量营养素的含量为(/100 g):蛋白质2.8 g,脂肪4.9 g,碳水化合物6.9 g。将实验室生产完成的液态配方乳转入25、30、40 ℃样品稳定性测试储藏室,在三种储藏温度下储藏六个月,每间隔1个月取样检测。由于前期实验结果显示,液态配方乳在25 ℃和30 ℃储藏时,样品的变化程度相近,上下层脂肪和蛋白质含量无明显变化。为比较储藏温度对脂肪上浮和蛋白质下沉情况的影响,上、下层脂肪和蛋白质含量、上层粒径、下层矿物质含量只检测储藏温度为25、40 ℃的样品。用T25、T30、T40分别代表储藏条件为25、30、40 ℃。

1.2.2 检测指标

1.2.2.1 pH 取80 mL样品,放入转子并置于磁力搅拌器上混和均匀,同时插入校正好的pH计进行测量,待数值稳定后记录pH。

1.2.2.2 粒径和Zeta-电位 参照Nobuhara[9]方法,取10 μL样品用磷酸盐缓冲溶液(0.05 mol/L NaH2PO4,0.05 mol/L Na2HPO4,pH7.0)稀释1000倍,摇匀后使用Zetasizer Nano ZS 马尔文纳米粒度电位仪测定样品粒径(平均粒径)和Zeta-电位。分散相折射率为1.330,黏度为0.8872 cP,介电常数为78.5。

1.2.2.3 黏度 取200 mL样品倒入特制烧杯中,选择LV-01(61)转子,设定转速为100 r/min,使用DV2T粘度测定仪测定液态配方乳黏度。

1.2.2.4 颜色变化 参照Fernandez[10]方法,取20 mL样品测量CIE参数L*、a*、b*,每次测量前分别进行仪器矫正及绿板测试。L*代表颜色亮(+)或暗(-),a*代表颜色红(+)或绿(-),b*代表颜色黄(+)或蓝(-)。结果用色差ΔE表示:

式中:ΔL*、Δa*、Δb*为每月测量值与0月测量值的差值。

1.2.2.5 上下层脂肪含量测定 样品取出静置48 h后,小心吸取上层及底层乳样10 g,按照GB 5009.6-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中第三法碱水解法进行测定。

1.2.2.6 上下层蛋白质含量测定 参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中第一法凯氏定氮法。取样静置48 h后,小心吸取上层及底层乳样10 g于凯氏定氮消化管中,加入两片凯氏定氮消化片,15 mL浓硫酸,5 mL H2O2,连接好排废装置,200 ℃消解1 h后升温至420 ℃消解1.5 h,冷却至室温后于自动凯氏定氮仪上进行测定。

1.2.2.7 下层矿物质含量测定 参照GB 5009.268-2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》中第一法电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)。称取0.5 g下层乳样至于微波消解管中,加入0.5 mL锗标准内标溶液,5 mL硝酸及2 mL双氧水,放入微波消解炉消解。样品消解完成后,加入20 mL超纯水,转移至50 mL容量瓶中,再加入0.5 mL甲醇,最后用超纯水定容至刻度线,于ICP-MS(Agilent 7900)上机分析。ICP-MS分析条件如下:频射功率为1550 W,采样深度为6.5 mm,载气为氩气,流量为0.9 L/min,稀释气流量为0.2 L/min,蠕动泵转速为0.1 r/s,清洗时间为360 s。

1.2.3 数据分析 实验数据为三次实验结果的平均值,使用Excel软件处理实验数据及图表制作,结果表示为平均值±标准差。采用SPSS statistic 20.0软件对数据进行方差分析、相关性分析及回归分析。

2 结果与分析

2.1 液态配方乳pH变化

液态配方乳储藏期间pH变化如图1所示,由图1可知,液态配方乳pH随储藏时间延长呈下降趋势。随储藏温度的升高,pH下降程度逐渐增大,液态配方乳储藏5个月后,25、30 ℃时pH无显著差异(p>0.05),而在40 ℃时,其pH下降最快,且从第三月开始显著(p<0.01)低于其他两个储藏温度的pH。这与Gaucher等[17]研究结果一致,Gaucher研究发现UHT乳在40 ℃下储藏6个月后,pH由6.7下降到6.2,且明显低于其它温度,证明了储藏温度的升高加速pH下降。液态配方乳储藏过程中,脂肪在氧气的作用下发生脂肪氧化反应[11],生成游离脂肪酸、小分子有机酸等产物,会导致pH的下降。并且,有研究表明,随储藏温度升高,氧化速率加快,游离脂肪酸等产物生成速率变快[12],这可能是pH在40 ℃时下降更快的原因。

图1 液态配方乳储藏期间pH变化

2.2 液态配方乳粒径变化

液态配方乳储藏期间粒径变化如图2所示,样品在25、30 ℃储藏4个月内,粒径大小基本保持稳定,从初始277.8 nm分别增加至283.9和288.3 nm,储藏6个月时粒径迅速增大,分别增加至312.9和332.1 nm。而在40 ℃储藏6个月后,粒径增加至382.5 nm,极显著高于其他两个温度下样品的粒径大小(p<0.01)。实验结果表明,粒径随储藏时间延长而增大,同时也受到温度的影响,这与郭奇慧等[8]的研究结果一致。由于液态配方乳属于热不稳定体系,体系中分子会在布朗运动作用下发生碰撞合并,而温度越高,外界提供的热能越大,布朗运动越剧烈[13],粒子碰撞的效能及频率增加,最后乳滴聚集,导致分子粒径增大。另一方面,储藏时间的延长，温度的升高及储藏过程中pH的下降也会促进蛋白质胶体中磷酸钙的溶解,并从酪蛋白胶束中解离出来。解离出来的钙离子可以与蛋白质络合形成“钙桥”,从而促进酪蛋白随后的聚集,使粒径增加[14]。

图2 液态配方乳储藏期间粒径变化

2.3 液态配方乳Zeta-电位变化

Zeta-电位是分散体系稳定性的重要指标,Zeta-电位的绝对值越大代表分散相稳定性越高。液态配方乳储藏期间Zeta-电位变化情况见图3,由图3可知,粒子所带负电荷在0～6 月储藏期内呈先增加后减少的趋势,样品在25、30 ℃储藏3个月时,在40 ℃储藏2个月时颗粒所带负电荷最多。Thaddao等[15]在乳液储藏过程中也观察到颗粒所带负电荷随储藏时间延长逐渐增加的现象,并认为脂肪氧化成生的游离脂肪酸及小分子有机酸主要分布在颗粒的油水界面上,并以COO-的形式存在于颗粒表面,使颗粒所带负电荷增加[16]。

图3 液态配方乳储藏期间Zeta-电位变化

在储藏后期,颗粒所带负电荷逐渐减少,6个月后,样品在40 ℃所带负电荷为-16.5,颗粒所带负电荷减少,分子间斥力降低,即分散相抗聚集的能力逐渐减弱[17]。推测其原因,可能是由于储藏后期样品颗粒变大,比表面积变小,颗粒表面可分布的COO-减少。Gaucher等[17]研究发现UHT乳在6个月储藏期内Zeta-电位均约为-19,只有在40 ℃储藏6个月后有轻微下降。本研究中得到的结果与之不同,这可能是由于液态配方乳中添加了较丰富的营养素,其配方体系的复杂性及营养成分的多样性导致分散相稳定性在储藏过程中发生改变而表现出不同的结果。

2.4 液态配方乳黏度变化

乳液在储藏过程中流动性的损失会使产品形成凝胶,主要表现为产品黏度的变化。液态配方乳储藏期间黏度的变化如图4所示,结果显示,储藏过程中黏度呈下降趋势,样品在25、30 ℃储藏6个月后,其黏度略有下降,从最初的5.27 cP分别下降至4.88和4.97 cP,两温度之间无显著差异(p>0.05)。在40 ℃储藏6个月后,黏度下降至4.46 cP,极显著低于其他两个温度(p<0.01),且黏度在40 ℃储藏第一个月及储藏后期下降速度较快,1～4月下降速度较缓慢。闫志国[18]研究发现,在储藏初期产品黏度降低,随后一段时间黏度基本保持稳定,最后迅速上升,短期内形成凝胶。由于粘度的升高主要与蛋白质的高度聚集有关[5],而本研究中蛋白质在底层虽有轻微聚集,但没有出现明显沉淀及凝胶现象,所以并未观察到液态配方乳黏度下降后再上升的过程,这与任龙梅等[19]的研究结果一致。

图4 液态配方乳储藏期间黏度变化

2.5 液态配方乳颜色变化

储藏期间,乳中赖氨酸ε-氨基基团与乳糖发生美拉德反应,在美拉德反应的最后阶段,中间产物经一系列变化最终生成棕褐色物质类黑精,使液态乳颜色发生改变[20]。本研究以ΔE来表示液态配方乳储藏期间颜色的变化,结果见图5。液态配方乳ΔE随储藏时间延长呈线性上升,且储藏温度越高,颜色变化速度越快,显著性分析结果显示,储藏时间、储藏温度对ΔE影响极显著(p<0.01)。液态配方乳在40 ℃储藏6个月后,已经可以肉眼观察到样品产生了严重的褐变。有研究认为乳中颜色变化是由b*值引起的[17],实际上,本研究中液态配方乳颜色变化主要是由L*值和b*值共同作用的结果,L*值的降低说明样品颜色逐渐变暗,b*值越大说明样品颜色越偏向黄褐色,样品在25、30、40 ℃储藏6个月后,L*值由87.36分别降至84.58、83.15和80.23,b*值由13.41分别增加至14.64、15.93和19.08。这说明储藏温度越高,美拉德反应速率越快,液态配方乳褐变越严重,最终导致产品颜色改变。

图5 液态配方乳储藏期间ΔE、L*、b*变化

2.6 液态配方乳脂肪变化

通过测量液态配方乳储藏期间上、下层脂肪含量来评价样品脂肪上浮的情况,如图6(A)所示,液态配方乳在25 ℃储藏3个月后开始出现脂肪上浮的情况,储藏6个月后上、下层脂肪含量分别为5.62和4.25 g/100 g且存在显著性差异(p<0.05),样品在40 ℃储藏2个月后,上层脂肪含量呈线性快速增长,下层脂肪含量也略有下降,6个月后,上层脂肪含量高达11.54 g/100 g,说明液态配方乳储藏温度越高,脂肪上浮速度越快,这与王晓兰等的研究结果结果一致[21]。如2.2中所述,随储藏时间延长及温度上升,内部脂肪游离出来重新聚集成大分子脂肪球,浮于乳液表面,严重时可在顶部出现分层现象。Durand[22]研究发现脂肪球上浮速度与黏度有关,黏度越大,脂肪上浮速率越慢。根据图4显示,液态配方乳在40 ℃时黏度下降,使脂肪球迁移速率增加,进而导致脂肪快速上浮。上层脂肪粒径结果见图6(B),样品在40 ℃储藏6个月后,上层乳样平均粒径增加至446.4 nm,远远大于此时样品平均粒径382.5 nm,样品粒径越大,比重越小,向上运动速度越快,这也是脂肪球颗粒迁移、聚集,浮于顶层的有力证据之一。

图6 液态配方乳储藏期间脂肪及上层粒径变化

2.7 液态配方乳蛋白质含量变化

配方液态乳经高温处理会引起某些化学和物理变化,导致其储藏稳定性降低,可能会在容器底部形成蛋白质沉积物(沉淀)。本研究通过测量液态配方乳上、下层蛋白质含量评价其储藏期间沉淀生成情况,结果见图7。液态配方乳在25 ℃储藏6个月后,上、下层蛋白含量(2.64 g/100 g和2.77 g/100 g)尽管从数值上看相差不大,但是其变化是显著的(p<0.05),证明常温储藏时,液态配方乳中蛋白质聚集的速度较慢。而样品在40 ℃储藏1个月后,下层蛋白含量开始显著(p<0.05)高于上层,且从第3个月开始与25 ℃存在极显著差异(p<0.01),40 ℃储藏6个月后上、下层蛋白含量分别为2.35 g/100 g和3.42 g/100 g。Lu等在全脂UHT乳储藏120 d后也发现样品上层蛋白质含量下降,下层蛋白质含量上升的现象[23]。

图7 液态配方乳储藏期间蛋白质变化

液态配方乳储藏期间蛋白质分层现象的出现是乳液体系中正常现象,40 ℃时下层蛋白质含量较高,可能与pH的变化有关,pH的降低会导致蛋白质分子间静电斥力降低,破坏分子间各种作用力的平衡状态,此时静电斥力较弱,范德华力占主导地位,液滴趋向于聚沉[24]。液态配方乳在40 ℃储藏3个月后pH下降到6.52,因此,pH的下降可能是导致样品在40 ℃时蛋白质分层较严重的原因之一,但是在整个储藏期间,样品底部没有观察到明显的沉淀现象。

2.8 液态配方乳矿物质含量变化

乳中蛋白质是在各种离子组成的平衡体系中处于稳定状态的,当储藏条件发生改变不能维持原有平衡时就会导致蛋白质聚集,生成沉淀。因此,本研究测量了液态配方乳下层乳样中矿物质含量,结果见表1。随储藏时间延长,下层乳样儿中矿物质含量呈上升趋势,液态配方乳在40 ℃储藏第2～3个月后,其下层矿物质含量开始与25 ℃存在显著差异(p<0.05),这与下层蛋白质含量变化一致。因此,对下层矿物质与下层蛋白质含量进行相关性分析,结果见表2。40 ℃时,Ca、P、Mg、Fe、Zn含量与蛋白质含量极显著相关(p<0.01),证明矿物质可影响蛋白质沉淀的生成。其中Ca含量与蛋白质含量相关系数最大,Boumpa[25]认为由于钙离子促进了酪蛋白胶束的聚集,在热处理过程中,当温度大于100 ℃时,酪蛋白胶束中的胶体磷酸钙开始溶解,并从酪蛋白胶束中解离出来,与蛋白质络合形成“钙桥”[26]。同时,储藏过程中pH的下降也会促进胶体磷酸钙的溶解,从而促进酪蛋白随后的聚集[24]。由此推测Mg、Fe等矿物质在乳中也可形成与“钙桥”类似的结构,进而影响蛋白质沉淀。

表1 液态配方乳储藏期间下层矿物质含量变化Table 1 Change of minerals in liquid formula milk during storage

表2 液态配方乳下层蛋白质与矿物质含量相关性分析Table 2 Correlation analysis of protein and minerals content in the bottom of liquid formula milk

2.9 液态配方乳物理指标与储藏时间回归分析

为进一步评价储藏过程中物理指标的变化情况,以储藏时间为自变量,各物理指标为因变量,进行回归分析,确定其反应级数,结果见表3。pH和黏度的下降遵循一级反应动力学,粒径、色差、上层脂肪和下层蛋白的变化遵循零级反应动力学。在40 ℃时,各指标反应速率常数的绝对值皆较常温时高,如pH和黏度在40 ℃时K值分别为25 ℃时的2.21和2.08倍,粒径和色差在40 ℃时K值分别为25 ℃时的2.95和2.77倍,这说明不同指标在同样的加速条件下对常温下货架期的预测关系是不同的,即各个指标具有不同的加速因子,在进行货架期预测时不可一概而论。所有进行回归分析的指标中,pH和色差随储藏时间的变化关系较密切。pH在各温度下R2分别为0.822、0.866和0.995;色差在各温度下R2分别为0.937、0.984和0.975。因此,pH和色差具备作为今后货架期预测指标的潜力。另外,粒径、上层脂肪、下层蛋白在40 ℃时R2分别为0.951、0.962、0.960,是可以用于判断产品货架期稳定性的重要指标。

表3 液态配方乳物理指标与储藏时间的回归分析Table 3 Regression analysis of physical index and storage time of liquid formula milk

3 结论

本文研究液态配方乳在不同温度下储藏6个月内物理性状的变化。从整个储藏过程来看,液态配方乳在25及30 ℃下,各物理指标均相对稳定。在40 ℃储藏6个月时,pH、黏度呈下降趋势,Zeta-电位呈先下降后上升的趋势,粒径、颜色变化、脂肪上浮、蛋白质沉淀皆呈上升趋势。各项物理指标随温度升高,变化速度加快。相关性分析显示,矿物质影响蛋白质沉淀生成。回归分析结果表明,不同指标在同样的加速条件下对常温下货架期的预测关系是不同的,实际操作时需根据产品的配方特性筛选出适用的指标进行货架期预测。液态配方乳营养成分复杂,在运输及储藏过程中遇到温度过高的情况时,应注意其温度的控制,尽可能减少储运过程中产品品质的下降。