硬脂酸改性苏云金杆菌伴孢晶体蛋白对其抗紫外线作用及杀虫活性的影响

谢烽，林婷，胡斌，朱瞬瞬，陈梦丽，乔丽雅，朱国念

(浙江大学 农药与环境毒理研究所，浙江 杭州 310058)

苏云金芽孢杆菌(Bacillusthringiensis，Bt)是一种革兰氏阳性菌，在形成芽孢的同时能产生伴孢晶体，又称杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)，对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目昆虫及动植物寄生虫线虫等有特异性毒杀作用，而对人畜无害，不污染环境，在农林卫生害虫防治中应用广泛[1-3]。虽然Bt作为微生物杀虫剂在全球范围内已经大面积推广应用，但也存在药效不稳定的普遍现象，Bt杀虫的主要活性成分伴孢晶体极易受到温度、pH值、紫外线等外界因素的影响而降低其杀虫活性[4-6]。有研究表明，对Bt-HD1菌株经过紫外线辐射12 h后，发现其对棉铃虫幼虫毒力丧失[7]。由于Bt制剂具有药效不稳定、田间持效性短等缺点，已成为影响Bt在我国农业生产中实际用于推广的主要制约因素。本研究利用硬脂酸作为改性剂，对Bt伴孢晶体进行表面包覆改性，并对改性后的产物进行表征和抗紫外线能力的测试，旨在为发展高效、安全的Bt生物农药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌株

苏云金芽胞杆菌为本实验室分离保藏的菌株。

1.1.2 供试虫源

二化螟由本实验室从浙江金华市水稻田中采集，室内培养繁殖。其培养条件为：相对湿度70%，温度(25±1) ℃，光照周期L∶D为16 h∶8 h。

1.1.3 培养基

液体LB培养基和PM培养基均参照文献[8]配制，用于Bt细菌的发酵培养。

1.2 伴孢晶体的分离与纯化

Bt菌株固体平板活化24 h，30 ℃，200 r·min-1液体摇瓶培养，至镜检晶孢完全分离，参考液体双水相体系分离法[9]分离晶体蛋白。将分离得到的BT晶体蛋白用去离子水洗涤2遍后，重新悬浮于去离子水中备用。

1.3 伴孢晶体的覆膜改性

称取一定量的硬脂酸溶于正丁醇中，配成6%的硬脂酸-正丁醇溶液。将苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体与硬脂酸按1∶1的质量比混合，40 ℃条件下以600 r·min-1的转速搅拌1 h，静置沉淀，倾去上层清液，用乙醇清洗沉淀，洗掉多余的硬脂酸，收集沉淀，35 ℃温度下烘干即得到硬脂酸改性的Bt伴孢晶体。

1.4 紫外线照射对改性前后伴孢晶体杀虫毒性的影响

将覆膜改性前后的Bt伴孢晶体蛋白分别置于培养皿中，紫外灯照射，每隔2、4、6、8、16、24、48 h取样，将取出的样品配制成1.5×108个·mL-1浓度的悬浮液。选取室内培养的健壮一致的分蘖期水稻苗，洗净，剪成10 cm长的带根稻茎，晾至表面无水痕，待用；将准备好的稻苗植株在配制好的溶液中浸渍30 s，取出晾干，用脱脂棉包住根部保湿，置于大号试管中；每个试管挑取20头三龄期二化螟幼虫，管口用黑色棉布罩住。每处理设4个重复，并设空白对照。处理后的试虫置于温度为(25±1)℃、相对湿度为70%～80%、光照周期为L∶D为16 h∶8h条件下饲养和观察，72 h后检查二化螟幼虫的死亡率。

1.5 改性后的伴孢晶体蛋白防治二化螟田间试验效果

试验于2018年7月在浙江温岭市植保站试验基地进行。将改性覆膜后的Bt伴孢晶体制成油悬浮剂进行田间药效试验，在二化螟1～2龄幼虫发生高峰期，以常用的化学杀虫剂氯虫苯甲酰胺和市售Bt可湿性粉剂作为对照药剂，清水为空白处理，采用无人机飞防喷雾法进行。调查药后21 d的防治效果、采用五点取样法，每点调查10丛水稻，统计10丛水稻内总枯心株数，同时全田调查50丛分蘖数，计算枯心率、防治效果。

1.6 数据分析

利用Excel 2010与DPS数据处理系统软件对试验数据进行统计，并以单因素的新复极差法对结果进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)

SEM与TEM观察改性覆膜前后的Bt伴孢晶体结果如图1所示，其中A1、A2分别为覆膜改性前后Bt伴孢晶体的SEM，B1、B2分别为硬脂酸改性覆膜前后的Bt伴孢晶体的TEM。从SEM图片中可以看出，改性前的Bt伴孢晶体蛋白表面较平滑，结构致密，晶角及各棱边平滑尖锐；改性后的Bt伴孢晶体蛋白的表面比较粗糙，晶角及棱边钝化，变得圆润，晶体表面呈连续波浪状。通过TEM照片可以看出，其表面均匀的包覆了一层厚度约40～60 nm的包覆层(图B2箭头所示)。

A1、A2分别为覆膜改性前后Bt伴孢晶体的SEM，B1、B2分别为硬脂酸改性覆膜前后的Bt伴孢晶体的TEM。图1 Bt伴孢晶体改性前后的SEM及TEM

2.2 紫外线照射改性覆膜前后的Bt伴孢晶体对二化螟幼虫的室内毒力测定

从图2可以看出，覆膜改性前的Bt伴孢晶体蛋白在经紫外线照射2 h后，对二化螟幼虫的毒力明显下降，死亡率仅为60%。紫外线照射5 h后，杀虫活性下降超过50%；照射24 h后，仅剩20%的死亡率。而覆膜改性后的Bt伴孢晶体蛋白，在紫外线照射24 h后，二化螟幼虫仍有70%的死亡率。

图2 紫外线照射改性覆膜前后的Bt伴孢晶体对二化螟幼虫的毒力比较

2.3 改性后的Bt伴孢晶体蛋白防治二化螟田间试验效果

由表1可见，改性后的Bt晶体108·mL-1油悬浮剂，667 m2用量100 mL处理对二化螟的防效为76.6%，明显优于市售32 000 IU·g-1Bt可湿性粉剂100 g，与化学药剂20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂20 mL处理的效果接近，二者无显著性差异。

表1 改性后Bt伴孢晶体蛋白防治田间 二化螟的杀虫效果

注：同列数据后无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3 小结与讨论

粉体表面改性是应现代高技术、新材料产业，特别是功能材料产业发展而兴起的新技术，对提高无机粉体的应用性能和价值起着至关重要的作用[10]。目前粉体改性技术主要集中在对无机粉体领域，少见对有机材料或生物材料改性的报道。本研究首次利用粉体表面改性技术，以硬脂酸为改性剂，对Bt伴孢晶体进行表面覆膜改性处理。结果表明，硬脂酸能够在Bt伴孢晶体上形成均匀的硬脂酸膜，厚度约20～40 nm。Bt伴孢晶体在紫外线的照射下，杀虫活性迅速下降，仅2 h就下降28%，照射24 h后，相比对照只剩下24%的毒性；而覆膜改性后的Bt伴孢晶体，在紫外线照射24 h后仍保持76%的杀虫活性，说明Bt伴孢晶体上覆的这层硬脂酸膜能有效阻隔紫外线对晶体蛋白的穿透及活性的影响，从而延长了Bt伴孢晶体蛋白的防效及持效性。田间药效试验结果进一步表明，与市售32 000 IU·g-1Bt可湿性粉剂相比，改性后的Bt伴孢晶体对二化螟的杀虫效果明显提高，与常用的化学杀虫剂氯虫苯甲酰胺的防效接近。同时，这种改性覆膜工艺操作简单方便，高效，具有广泛的应用前景。