爆破脱芽工艺对降低银杏果毒性的作用研究

戚怡婷 成玉梁 于航 谢云飞 郭亚辉 钱和 姚卫蓉

摘要 [目的]建立高效脱毒方法，为研制安全的银杏果新产品提供思路。[方法]利用手提式高压蒸汽灭菌器爆破银杏果并脱除胚芽，以不同浸泡时长、加水量、爆破压力和时间探究开口率和脱芽率，建立高效液相色谱法检测脱芽前后的银杏酸和银杏内酯B含量的变化，并将脱毒后的银杏果加工成休闲食品。[结果]当银杏果浸泡4 h后，加入200 mL水在0.142 MPa下爆破30 min，最高开口率达8198%。银杏酸大量存在于胚芽中，脱除胚芽后的银杏果毒性减少93.69%，银杏内酯无显著性差异。加工后的黄油椰蓉味银杏果经感官评定无明显苦味且外形和口感不受影响。[结论]该方法降低银杏果毒性方便有效，为银杏产品的开发和食用安全性提供了基本保证。

关键词 银杏果;高压蒸汽;银杏酸;银杏内酯B;胚芽

中图分类号 TS201.6文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）13-0158-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.049

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Detoxification of Ginkgo biloba Seeds by Splitting Shells and Removing Gametophytes

Abstract [Objective] To establish an efficient detoxification method for the development of new safe Ginkgo products. [Method] Gbs were split by the high pressure steam sterilizer and gametophytes were removed. The splitting rate and removal rate were investigated by different soaking time， amount of adding water， steaming pressure and steaming time. The changes of ginkgolic acid and ginkgolides B before and after split were analyzed by a highperformance liquid chromatographic （HPLC）. The detoxified Gbs were developed into snack food. [Result] It showed that when Gbs were soaked for 4 h and steamed with 200 mL water at the highest pressure of 0.142 MPa for 30 min， the splitting rate was the highest with 81.98%， and the highest detoxification rate was 93.69% while the content of ginkgolide B was not reduced obviously. The buttery coconut flavored snack food had no adverse effects on shape and flavor and without bitterness by preference sensory evaluation. [Conclusion] The method of reducing toxicity was convenient and effective， and provided a basic guarantee for the edible safety of Ginkgo products.

Key words Ginkgo biloba seeds;High pressure steam;Ginkgolic acid;Ginkgolide B;Gametophytes

基金項目 2017年江苏省林业科技创新与推广项目（LYKJ[2017]26）。

作者简介 戚怡婷（1994—），女，江苏常熟人，硕士，研究方向：食品安全与质量控制。*通信作者。

收稿日期 2019-02-25;修回日期 2019-03-25

银杏最早出现在3亿年前的石炭纪，素有“活化石”的美名[1]。我国银杏资源丰富，占世界总量的70%。银杏果是一种营养价值很高的干果，含有多种活性化合物，如黄酮、内酯、鞣酸和抑菌蛋白等[2]。它能起到抑制真菌[3]、抗过敏、抗氧化[4]、消炎[5]、耐缺氧[6]、通畅血管[7]、改善大脑功能、治疗老年痴呆症[8-9]和改善脑供血不足[10]的作用。然而，银杏果含有毒素，如果食用过量，会引起痉挛、意识丧失等中毒症状[11]。

现普遍认为，银杏的主要毒性源于种仁中的胚芽，包括银杏酸、氢氰酸和4′-O-甲基吡哆醇（MPN）。然而，对这些有毒物质在银杏果中含量分布的评估却很少。据报道，银杏叶、外种皮和银杏果中总银杏酸的浓度不同，但均高于国际和国内标准[12]。田晓清等[13]测得胚芽中的银杏酸含量最高，为64.415 μg/g，其次是内种皮、中种皮、胚乳。另有人对罐头和煮熟的银杏果中的MPN进行了测定，发现含量仅为生银杏果的1%[14]，表明加热可有效降低MPN。而银杏果中的氢氰酸属于安全范围[15-16]。可见，银杏酸是银杏果中主要毒性物质。最近研究表明，银杏内酯B是一种有效的血小板活化因子（PAF）拮抗剂，可用于治疗哮喘、内毒素休克和移植排斥反应[17]。

检测方法方面，有研究使用了超临界流体色谱法测定银杏果中的银杏酸浓度[18]，也有人采用液质联用方法对银杏叶中的营养成分进行了测定[19]。而银杏内酯的检测一般采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）或液相色谱-质谱法（LC/MS）[20-21]。可见，高效液相色谱法是一种常见的有效方法。

目前，银杏制品的脱毒方法主要有加热、干燥、醇提、物理去除等。通常采用物理脱毒法处理银杏果，如烹饪或去壳后干燥制成粉末。然而，对于烹饪或油炸脱毒法，尚无明确的科学依据。笔者研究了银杏果中毒性物质的含量分布，提出了高压蒸汽爆破银杏果脱除胚芽的新方法，探究了脱芽前后银杏酸和银杏内酯B的浓度变化，并将脱芽后的银杏果制成黄油椰蓉味休闲产品，既保证了银杏果的食用安全，又为银杏果深加工和综合利用提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

总银杏酸（C13∶0、C15∶1、C17∶2、C15∶0和C17∶1）标准品购于上海同田生物技术股份有限公司;白果酸（C15∶1）标准品购于北京百灵威科技有限公司（纯度98%）;银杏内酯B由国家食品药品监督管理局提供（纯度95.6%）;无水甲醇和正己烷为色谱级，其他试剂均为分析级，购自国药集团化学试剂有限公司;试验所用银杏果均来源于江苏省邳州市银杏源生物工程有限公司，品种为马蹄。

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）;超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用仪（美国Waters公司）;手提式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）;旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）;数显恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）;离心机;电子分析天平（德国Sartorius仪器公司）;Direct-Q5超纯水系统（美国Millipore公司）;电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 方法

1.2.1 银杏果爆破及脱芽工艺。

将新鲜银杏果洗净，除去破损、霉变及漂浮的颗粒，在蒸馏水中分别浸泡0、4、8或12 h，取出500 g银杏果分成4组，分别加入0、100或200 mL水进行爆破，控制压力范围在0.09～0.142 MPa下加工15～30 min。

银杏果果壳受高温高压开口破裂，果中胚芽自动脱落，人工统计银杏果开口数和胚芽脱除数，得开口率及脱芽率。计算公式如下：

开口率=开口银杏果数/银杏果总数×100%

脱芽率=开口银杏果胚芽掉落数/开口银杏果含芽总数×100%

另沿银杏果边缘纵向测量开口长度，除以银杏壳边缘总周长，记录其≥1/2的银杏果数，以确定不同条件下的爆破效果。

1.2.2 银杏酸和银杏内酯B含量的测定。

1.2.2.1 银杏酸含量。

①液相色谱条件。

采用Agilent 1260型高效液相色谱仪检测，Waters XBridge C18色谱柱（46 nm×250 nm，5 μm），流動相是甲醇∶水（3%冰醋酸）=90∶10，柱温为30 ℃，检测波长310 nm，流速1.0 mL/min，进样量20 μL。

②标准曲线。

将银杏酸混标和白果酸标品用无水甲醇溶解、定容，分别稀释至浓度为1 000、500、200、50、5、0.5 μg/mL，用0.45 μm 的有机滤膜过滤，得银杏酸标准溶液。以银杏酸浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作图，得标准曲线。

③银杏酸的提取。

将银杏果在50 ℃电热鼓风干燥箱中烘干并粉碎。取2.5 g粉末置具塞锥形瓶中，加入50 mL甲醇，称定质量，70 ℃水浴中加热回流3 h，放冷再称定，用无水甲醇补足，过滤。取30 mL滤液，旋转蒸发浓缩至干，加20 mL碳酸钠-盐酸缓冲溶液（pH 2.5）混悬残渣，并用正己烷萃取3次，每次10 mL，再次浓缩至干，残渣用无水甲醇定容至2 mL[13]，10 000 r/min离心3 min后取上清液测定。

1.2.2.2 银杏内酯B含量。

①液相色谱条件。

通过超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用仪测定，BEH C18 50 mm分析柱，柱温为45 ℃，进样量1 μL。流动相A是甲醇，流动相B是0.1%甲酸。初始流动相（10%A和90%B）在01 min内保持恒定，然后在7 min内梯度洗脱至100%A，最后在7.1 min内返回起始。总运行时间为10 min，流速为03 mL/min。

②标准曲线。

将银杏内酯B标准品溶于无水甲醇，逐渐稀释至95、38、19、9.5、4.75、1.187 5 μg/mL，用045 μm 的有机滤膜过滤，得银杏内酯B标准溶液。以银杏内酯B浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作图，制标准曲线。

③银杏内酯B的提取。

精确称取银杏果粉末2.0 g，加入50%乙醇置索氏提取器中70 ℃提取2 h，冷却过滤，滤渣加入50%乙醇溶液再提取2 h。合并2次提取液旋转蒸发至干，加入10 mL蒸馏水和0.3 g乙酸钠溶解残渣，以等体积乙酸乙酯萃取2次，合并有机相旋转蒸发至干，残渣用无水甲醇定容至2 mL[22]，10 000 r/min离心3 min后取上清液测定。

1.2.3 银杏果休闲食品的制作及感官评定。

选择爆破脱芽后的银杏果剥去外壳后待用。将低筋面粉、玉米淀粉和木薯淀粉以40∶5∶55混合，在浓度为28.5%的糖水中加入2%碳酸氢铵，搅拌混匀后放置5 min。将混合物等分成若干份后均匀包裹银杏果，置170 ℃烤箱中烘烤15 min， 取出涂抹黄油和烘焙过的椰蓉（1∶2）混合物，继续烘烤5 min。

为对该产品进行偏好型感官评定，笔者邀请15名感官评定人员参与评估，根据产品的形状、色泽、风味、质地和味道分别打分。 每项分为3个级别，最高分为2分，满分10分。

1.2.4 统计分析。

使用MassLynx V4.1对银杏内酯B数据进行分析，所有数据均使用Origin8软件处理，并采用SPSS软件对其进行方差分析（ANOVA）和均值差异性分析，显著性水平P<0.05。

2 结果与分析

2.1 银杏果中银杏酸含量及其分布结果

据已有报道，银杏酸其实是6-烷基或6-烯基水杨酸的衍生物，主要包括银杏酸C13∶0、C15∶0、C15∶1、C17∶1、C17∶2，化学结构式见图1。该试验中银杏果提取物中主要银杏酸种类与总银杏酸标准品相同。液相分析结果显示，银杏果中含5种主要银杏酸，各种银杏酸均得到较好分离，且基线稳定。其中，白果酸（C15∶l）含量最高，其次是C17∶1和C17∶2，这3种含量占总银杏酸含量的95%以上。

根据检测，原始银杏果中的总银杏酸含量约为255.30 μg/g。以白果酸（C15∶1）为例，在内种皮中约为4915 μg/g，在胚乳中为24.97 μg/g，而胚芽中约含4.47 mg/g，其具体分布详见表1。由表1可知，银杏果中毒性成分最多集中于胚芽中，大约占84.58%。可见，去除胚芽是降低毒性的有效方法。

2.2 高压蒸汽对银杏果爆破效果的影响

2.2.1 高压蒸汽对银杏果开口率和脱芽率的影响。

由图2A所示，无论是否加水，银杏果的开口率均在50%以上，但3种条件之间没有显著差异;当加水量为200 mL时，即加水没过银杏果，其开口率可达62.35%;脱芽率均在30%以上，也无显著性差异。而浸泡时间对银杏果爆破结果的影响如图2B所示。与未浸泡的银杏果相比，浸泡过后的银杏果开口率均较高，达70%以上，而浸泡4 h后的银杏果开口率高达81.98%。同样，浸泡后的脱芽率也高于未浸泡组，均在35%左右。该研究采用高压蒸汽灭菌器爆破银杏果，去除胚芽，其中蒸汽压力是重要的控制因素之一。图2C表明，随着蒸汽压力的增加，开口率逐渐增加。当使用灭菌器最高气压时，其开口率约达80%，与其他2种情况存在显著差异。而脱芽率基本不受影响，但在最高蒸汽压力下最高。因此，采用较高的蒸汽压力对爆破银杏果有较好的效果。由图2D可见，蒸煮时间对爆破结果的影响与蒸汽压力相同。随着蒸煮时间的延长，开口率逐渐增大，当银杏果蒸煮处理30 min后，其开口率达81.87%，比蒸煮15 min的开口率高33.63百分点，同样，该条件作用下的银杏果胚芽去除率为20%～30%，均无显著性差异。

2.2.2 高压蒸汽对银杏果开口大小的影响。

银杏果在不同高温高压条件下经蒸煮后形成不同的外观（图3）。图3A表明，顶部横向的平均开口大小为2～3 mm，去除胚芽的效果差异如图3B所示。除开口率外，开口大小也是判断爆破效果的标准。通过比较开口大小，也可以确定不同爆破条件的效果，从而获得最佳爆破条件。如图4所示，纵坐标表示开口大小≥1/2的银杏果数量。由图4A可见，与不加水相比，加水量越大，开口效果越好;当向水中加入200 mL水时，开口尺寸≥1/2的银杏果数量占全部开口数的42.11%。图4B所示的开口大小结果与图2B的开口率一致，当银杏果浸泡4 h时，对开口大小的影响最好;相反，浸泡时间超过4 h后，爆破效果减弱;未浸泡过的银杏果开口大小≥1/2的数量最少。从图4C可以看出，蒸汽压力对开口数大小影响明显;蒸汽压力越高，爆破效果越好;当压力达到0.142 MPa时，开口效果最佳。蒸煮时间对开口数大小的影响如图4D所示。由图

2.3 银杏果毒性和活性物质的含量变化

图5A比较了原始银杏果、蒸煮过的银杏果、脱芽后的银杏果和30%脱芽后的银杏果中白果酸（C15∶1）和总银杏酸含量。原始银杏果中银杏酸总量约为255.30 μg/g，远超限定标准。目前，欧洲药典和中国药典分别限定银杏叶提取物中银杏酸总量的最高浓度为5和10 μg/g[23]。该研究中，蒸煮过的銀杏果中仍然存在大量总银杏酸（图5A），而脱芽后的银杏果中银杏酸含量显著降低，其中白果酸（C15∶1）甚至被完全脱除，其脱毒率达100%（图5B）。由此证明，使用高压蒸煮并不能完全脱毒。该试验还测定了脱除30%胚芽的银杏果中银杏酸的含量，其中白果酸（C15∶1）为原始值的37.22%，总银杏酸为46.15%，表明去除了62.78%的白果酸（C15∶1）和53.85%的总银杏酸。

该结果与表1中检测到的白果酸在银杏果中的分布一致，说明银杏果中约有84.58%的毒性主要分布在胚芽中，而内种皮和胚乳中的毒性很少。因此，当利用高压蒸汽除去胚芽后，银杏果的毒性大大降低。

银杏果中代表性活性物质银杏内酯B在原始种仁中的含量约为91.52 μg/g（图6）。有报道称银杏叶中的银杏内酯含量为0.7%～0.8%[24]，另有人发现银杏果中的银杏内酯含量高于银杏叶[25]。该试验结果表明，原始银杏果和脱芽后的银杏果中银杏内酯B含量并没有显著差异。正如表1所示，银杏内酯B大量存在于胚乳而不是胚芽中，脱除胚芽不会明显影响银杏果中的活性物质含量，因此，使用高压蒸汽爆破银杏果可以为食品安全和营养提供基本保障。

2.4 银杏果休闲食品感官评定结果

按照上述方法制作银杏果休闲食品，烘焙后的成品外观如图3C所示。表2为15名感官评定员对食品形状、颜色、风味、质地和味道的评定结果。

由表2可见，与未脱去胚芽的完整银杏果相比，去除胚芽对制作的休闲食品外观并无影响，两者在颜色和形状上无显著差异（P>0.05）。相反，当银杏果脱除胚芽后，它在风味、质地和味道上更受欢迎，因为去除胚芽会减少银杏果本身的苦味，但仍保留它特有的香气。从得分情况看，脱除胚芽的银杏果平均分在1.78分以上，颜色和风味项得分较高。

该休闲食品不仅外观上容易被接受，而且还保留了银杏果特有的风味。因此，采用高压蒸汽对银杏果进行爆破脱芽以降低毒性是可行的，也为银杏产品的开发提供了理论依据。

3 结论与讨论

采用高压蒸汽对银杏果进行爆破，使其开口自动脱除胚芽可降低毒性。研究表明，脱芽能有效降低银杏酸含量，白果酸（C15∶1）脱除率可达100%。除此之外，银杏内酯B含量在脱毒前后无明显差异，但是否影响银杏果的其他药用性能还有待进一步研究。该加工方法对未来银杏产品的开发和食用安全性的保障具有重要意义。

参考文献

[1] 祖丽亚.银杏果实与叶的开发和利用[J].商业科技开发，1996（4）：34-35.

[2] 蒲丽丽.银杏的药用食用价值及在食品工业中的应用[J].农村经济与科技，2010，21（4）：110，53.

[3] OKEN B S，STORZBACH D M，KAYE J A.The efficacy of Ginkgo biloba on cognitive function in Alzheimer disease[J].Archives neurology，1998，55（11）：1409-1415.

[4] DEFEUDIS F V，DRIEU K.Ginkgo biloba extract（EGb 761）and CNS functions：Basic studies and clinical applications[J].Current Drug Targets，2000，1（1）：25-58.

[5] ILIEVA I，OHGAMI K，SHIRATORI K，et al.The effects of Ginkgo biloba extract on lipopolysaccharideinduced inflammation in vitro and in vivo[J].Experimental eye research，2004，79（2）：181-187.

[6] ERNST E.The riskbenefit profile of commonly used herbal therapies：Ginkgo，St.Johns Wort，Ginseng，Echinacea，Saw Palmetto，and Kava[J].Annals of internal medicine，2002，136（1）：42-53.

[7] MARCOCCI L，MAGUIRE J J，DROYLEFAIX M T，et al.The nitric oxidescavenging properties of Ginkgo biloba extract EGb 761[J].Biochem Biophys Res Commun，1994，201（2）：748-755.

[8] BIRKS J.Ginkgo biloba for cognitive impairment and dementia[J].Alzheimers & dementia，2006，2（3）：367.

[9] DEKOSKY S T，WILLIAMSON J D，FITZPATRICK A L，et al.Ginkgo biloba for prevention of dementia：A randomized controlled trial[J].Jama the journal of the American medical association，2008，300（19）：2253-2262.

[10] LEITE T C C，BRANCO A.Analysis of the package inserts for medicines to the base of Ginkgo biloba L.[J].Revista de ciencias farmaceuticas basica e aplicada，2010，31（1）：83-87.

[11] UDAKA N.High performance liquid chromatographic determination of ginkgotoxin and ginkgotoxin5′glucoside in seeds[J].Journal of liquid chromatography & related technologies，2006，29（4）：605-616.

[12] 李轉梅，张学兰，李慧芬，等.白果不同部位及不同炮制品中白果酸和总银杏酸定量比较[J].中成药，2015，37（1）：164-168.

[13] 田晓清，王锡昌，吴文惠，等.高压液相色谱分析法测定大佛指银杏酚酸含量[J].营养学报，2010，32（6）：608-611.

[14] LEISTNER E，DREWKE C.Ginkgo biloba and ginkgotoxin[J].Journal of natural products，2010，73（1）：86-92.

[15] CHEN P，HE F R，TAO J，et al.Female plant types of Ginkgo biloba L.in China[J].Forestry studies in China，2003，5（2）：17-22.

[16] 陈鹏，何凤仁，韦军，等.60Co和速冻对银杏种胚及氢氰酸含量的影响[J].江苏农学院学报，1994，15（1）：53-56.

[17] BRAQUET P G.The ginkgolides：Potent plateletactivating factor antagonists isolated from Ginkgo biloba L..Chemistry，pharmacology and clinical applications[J].Drugs of the future，1987，12（7）：643-699.

[18] WANG M，CARRELL E J，CHITTIBOYINA A G，et al.Concurrent supercritical fluid chromatographic analysis of terpene lactones and ginkgolic acids in Ginkgo biloba extracts and dietary supplements[J].Analytical & bioanalytical chemistry，2016，408（17）：4649-4660.

[19] LPEZGUTIRREZ N，ROMEROGONZLEZ R，VIDAL J L M，et al.Quality control evaluation of nutraceutical products from Ginkgo biloba using liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry[J].Journal of pharmaceutical & biomedical analysis，2016，121：151-160.

[20] WU Y L，LI Y J，DING G，et al.Qualitative and quantitative of ginkgo terpene lactone raw material by HPLC/QTOF MS combined with HPLCDADELSD[J].Analytical methods，2015，7（2）：667-674.

[21] 肖瑩，陈亮，黄杰，等.用HPLC-ELSD法测定复方银灵通胶囊中银杏总内酯的含量[J].药学服务与研究，2016，16（3）：200-202.

[22] 张峥，叶小玉，肖强，等.UPLC-TOF-MS快速测定不同核用银杏品种银杏叶中银杏内酯和白果内酯含量[J].天然产物研究与开发，2015，27（2）：286-288，300.

[23] 成亮，楼凤昌.银杏外种皮中银杏酚酸的研究概况[J].药学进展，2004，28（5）：209-213.

[24] 蒋明廉.不同采收期银杏叶总内酯及黄酮甙的含量测定[J].广西植物，1997，17（3）：283-285.

[25] 曹帮华，马海慧，梅林.银杏种仁黄酮与内酯含量变化初探[J].山东农业科学，2003（1）：16-19.