超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪检测动物源性食品中氟虫腈及其代谢物

黎小鹏 梁雪琪 陈楠 邓桂添 马世柱 周嘉诚 梁锦填

摘要 [目的]使用QuEChERS-EMR-Lipid前处理，超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪建立动物源性食品中氟虫腈及其代谢物的检测方法。[方法]优化后的前处理条件：以乙腈作为萃取溶剂，摇匀后，旋涡振荡1 min，以10 000 r/min常温离心3 min，取5 mL上清液倒入已活化好的EMR-Lipid dSPE增强型脂质去除净化管并放入陶瓷颗粒，剧烈振荡3 min，以10 000 r/min常温离心3 min;上清液全部转移至EMR-Lipid Polish反萃取管中加入陶瓷颗粒并立即剧烈振荡，超声至管内粉末全部溶解，以10 000 r/min常温离心3 min，吸200 μL到样品瓶中用超纯水定容到1 mL，旋涡振荡后上机检测。色谱条件：色谱柱为Poroshell 120  EC-C18，流动相为甲醇-水，在4.6 min内4种组分分离良好。质谱条件：喷射流电喷雾离子源（AJS ESI）;负离子模式同时扫描;多反应监测（MRM）采集方式。[结果]氟虫腈及其代谢物在0.1～20.0 ng/g均具有良好的线性关系，相关系数≥0.999，平均加标回收率为94.9%～113.0%，相对标准偏差为1.9%～4.9%，方法检出限为0.010～0.023 ng/g。[结论]超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪适用于动物源性食物中氟虫腈及其代谢物的快速检测。

关键词 QuEChERS-EMR;氟虫腈及其代谢物;动物源性食物;超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪

中圖分类号 TS207.3文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）14-0204-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.060

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract [Objective]A method for the determination of fipronil and its metabolites in animalderived foods was established using QuEChERSEMRLipid pretreatment and ultra performance liquid chromatographytriple quadrupole mass spectrometry.[Method]Optimized preprocessing conditions：acetonitrile as an extraction solvent， whirlpool concussion， centrifugal， adding supernatant into activated EMRLipid dSPE enhanced lipid removal purification tube， whirlpool concussion， centrifugal again. dilute the supernatant. Chromatographic conditions： chromatographic column： Poroshell 120 ECC18， mobile phase is methanol water， and 4 components are well separated in 4.6 minutes. Mass spectrum conditions： jet flow electrospray ion source （AJS ESI）; negative ion mode simultaneous scanning; multi reaction monitoring （MRM） acquisition mode.[Result]The calibration curves for fipronil and its metabolites had good linear relationship in the range of 0.1 - 20.0 ng/g， with correlation coefficients not less than 0.999. The average spiked recoveries ranged from 94.9% to 113.0% with relative standard deviations of 1.9%-4.9%. The limits of detection were in the range of  0.01-0.023 ng/g. [Conclusion]The method was applied in the determination for fipronil and its metabolites in animal derived foods with satisfactory results.

Key words QuEChERSEMRLipid;Fipronil and its metabolites; Foods of animal origin; Ultra high performance liquid chromatographytriple quadrupole mass spectrometry（UHPLCQQQ）

作者简介 黎小鹏（1965—），女，广东中山人，高级农艺师，从事农产品安全检测研究。

收稿日期 2019-01-22

氟虫腈是由法国罗纳-普朗克农化公司在1987 年所开发研制的苯基吡唑类高活性杀虫剂，化学名称（RS）-5-氨基-（2.6-二氯-4a-三氟甲基苯基）-4-三氟甲基亚磺酰基吡唑-3-腈基吡唑，锐劲特（Regent）是其商标的名称，英文的通用名称为 Fipronil。早期主要用于防治蔬菜、水稻、烟草、棉花、蓄牧业、公共卫生、贮存用品及地面建筑中各类别的作物害虫以及卫生害虫，杀虫谱广，活性高，且持效期长。但氟虫腈对蜜蜂和水生生物高风险，在水和土壤中降解慢[1]，危害生态环境安全，我国于2009年10月1日起禁用，目前，氟虫腈仅可用于卫生和玉米等部分旱田种子包衣剂[2]。氟虫腈被世界卫生组织列为“对人类有中度毒性”的化学品[3]，且其代谢物具有更高的毒性[4]，大量进食含有高浓度氟虫腈的食品，会损害肝脏、甲状腺和肾脏[5]。国际食品法典（CAC）和日本食品安全标准中规定，氟虫腈在蛋中的最大残留限量为0.02 mg/kg;美国相关标准规定，氟虫腈在蛋中的最大残留限量为0.03 mg/kg;欧盟相关标准规定，氟虫腈在食品中的最大残留限量为0.005 mg/kg，且不得用于人类食品产业链的畜禽养殖过程。美国环境保护局于2011年将氟虫腈列为C级致癌物[5]。

2017年7月20日，比利时通过欧盟食品和饲料类快速预警系统（RASFF）通报鸡蛋中检出氟虫腈，之后多个欧洲国家相继检出[6]。据报道，问题鸡蛋产自荷兰，氟虫腈被不恰当地用于养鸡场的清洁物品中，造成鸡蛋被检出残留物。此次污染事件因其使用的清洁用品非法添加了氟虫腈。8月26日，台湾农业主管部门发布新闻稿，经检验全台蛋鸡场氟虫腈残留超过定量极限标准的鸡蛋不合格的有44个蛋鸡场，逾100万颗鸡蛋回收封存或退回[7]。

我国国标中规定了多种种植业产品中氟虫腈的最大残留限量[8]，但未对任何动物源性食品做出规定。2016年11月，农业部发布《关于公开征求对食品中农药最大残留限量国家标准的意见的函》，该函中有2个附件，其中附件2中补充规定了氟虫腈在牛肉、脂肪、牛肾、牛肝、家禽肉类、家禽可食用内脏、蛋类及牛奶中的要求，但附件中规定的2个检测标准中均没有氟虫腈及其代谢物项目。在已发表的文献中[9-13]，对于动物源性食品中的氟虫腈及其代谢物前处理净化方法，常用QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，and safe，意为快速、容易、便宜、有效、简单和安全）或固相萃取（SPE）。该研究探讨使用对脂肪去除能力更佳的QuEChERS-EMR前处理方法，经过3次涡旋振荡离心，即可定容待测，使用超高液相色谱-三重四极杆质谱仪（LC-QQQ）同时测定动物源性食品中氟虫腈及其代谢物的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪UHPLC-QQQ 1290-6495，美国安捷伦公司;涡旋混合器XW-80A，上海精科实业有限公司;电子天平OHAUS-CP2102，奥豪斯仪器有限公司;3-30k高速冷冻离心机，SIGMA公司;超声波清洗机KQ-500E，昆山超声波仪器有限公司。

1.2 试剂

甲醇、乙腈均为色谱纯，德国Merck公司生产;EMR-Lipid dSPE增强型脂质去除净化管（PN：5982-1010），EMR-Lipid Polish反萃取管（PN：5982-0101），陶瓷均质子（PN：5982-9312），均为美国安捷伦公司生产。

氟虫腈及其代谢物：氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈硫醚，浓度1 000 μg/mL，所有标准品购自农业部环境保护科研监测所（天津）。混合后配成浓度为100 μg/mL混合标准溶液，经逐级稀释，上机前用空白基质将4种农药混标配制成校正曲线工作液，其浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L。

1.3 仪器条件

1.3.1

色谱条件。色谱柱为Poroshell 120  EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）;柱温45 ℃;流速0.4 mL/min;进样量5 μL;流动相：水-甲醇，梯度洗脱，详见表1。

1.3.2 质谱条件。喷射流电喷雾离子源（AJS ESI）;负离子模式同时扫描;多反应监测（MRM）采集方式;ifunnel高压120 V、低压90 V;干燥气温度200 ℃;干燥气流量14.0 L/min;雾化气压力241.3 kPa;鞘气温度350 ℃;鞘气流量10.0 L/min;毛细管电压3 kV;喷嘴电压1 500 V;MS及MS均为单位分辨率;碰撞能380 V;离子加速电压4 V;4种化合物的质谱采集参数见表2。

1.4 样品前处理

称取5 g（精确到0.01 g）的鸡蛋、鸡肉或牛奶样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈快速摇匀后，旋涡振荡1 min，以10 000 r/min冷冻离心3 min;等待离心时对EMR-Lipid dSPE增强型脂质去除净化管进行预处理，加入5 mL水并立即旋涡混合，备用;离心结束后吸取5 mL上清液到上述已活化好的EMR-Lipid dSPE增强型脂质去除净化管并放入2个陶瓷均质子，剧烈振荡1 min，旋涡混合2 min，以10 000 r/min常温离心3 min;上清液全部转移至EMR-Lipid  Polish反萃取管中加入2个陶瓷均质子，盖紧盖子并立即剧烈振荡，超声至粉末全部溶解，以10 000 r/min常温离心3 min，吸200 μL上清液到样品瓶中并加入800 μL超纯水，旋涡振荡后上机检测。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

液相连接两通，0.1 mg/L单标溶液进样5 μL，采用负离子扫描模式对相应模式的母离子进行扫描，待测物母离子均为[M-H]-，以准分子离子为母离子进行二级质谱扫描，得到各个化合物相应响应值最佳的碎片离子。

利用分子量计算器计算单同位素质量数，获得氟甲腈、氟虫腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈砜4个化合物的单同位素质量数分别为435.94、387.97、451.93和419.94。在MS Tune模式下，用单同位素质量数开展手动调谐方法研究。在电喷雾正离子电离（ESI +）模式下，4个化合物均無响应;在电喷雾负离子电离（ESI-）模式下，均有响应值高的分子离子峰[M-H]-，该试验采用负离子模式扫描，MRM参数详见表2。

2.2 流动相及色谱条件优化

该试验在相同梯度洗脱程序等液相条件下，比较不同有机溶剂（甲醇、乙腈作为流动相）的色谱分离效果，结果发现（图1～2），使用甲醇作为流动相时4种化合物有效分离;使用乙腈作为流动相时，氟虫腈砜与氟虫腈硫醚不能有效分离。所以该试验采用甲醇作为流动相。

2.3 前处理净化方法的选择

分别比较QuEChERS-EMR、QuEChERS、固相萃取（SPE）3种前处理净化方法，在样品中加入2 ng/g的氟虫腈及其代谢物混合标准品，计算3种前处理方法下的回收率。

2.3.1 QuEChERS-EMR净化。按“1.4”处理。

2.3.2 QuEChERS净化。按“1.4”前部分提取，第1次离心后吸取5 mL上清液至分散固相萃取试剂盒（15 mL离心管，含50 mg乙二胺-N丙基硅烷 PSA、150 mg C18 EC、900 mg硫酸镁，PN：5982-4950）中，放入2个陶瓷均质子，剧烈振荡1 min，旋涡混合2 min，以10 000 r/min常温离心3 min，取200 μL上清液到样品瓶中并加入800 μL超纯水，旋涡振荡后上机检测。

2.3.3 SPE净化。按“1.4”前部分提取，第1次离心后吸取2 mL上清液至玻璃试管中，50 ℃氮吹至近干，加入2 mL正己烷待净化;依次用5 mL V（丙酮）∶V（正己烷）=1∶9、5 mL正己烷预淋洗弗罗里矽SPE小柱（1 g，6 mL），小柱条件化后，加入上述2 mL提取物正己烷溶液，用5 mL V（丙酮）∶V（正己烷）=1∶9冲洗试管后洗脱弗罗里矽柱，重复1次，收集洗脱液，氮吹至近干，加入1 mL正己烷，涡旋混合，取200 μL到样品瓶中并加入800 μL超纯水，旋涡振荡后上机检测。

结果发现，3种净化方法的加标回收率无显著差异，详见表3;但使用质谱进行全扫描，其净化效果见图3，从图中可看出，QuEChERS-EMR的杂质峰更少，因EMR净化管对脂肪吸附能力更强，对动物源性样品的洁净效果更明显，则仪器清洁维护的成本可大大减少;从操作简易程度看，QuEChERS最快捷，但净化效果不够理想，SPE的净化效果与QuEChERS-EMR相当，但操作复杂，需时更长，10个样本约3 h完成净化处理，该试验选择QuEChERS-EMR作为净化方法。

2.4 定量方法的线性检测范围

以混合标准溶液的浓度为横坐标、各目标化合物色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，其线性关系相关系数、回归方程见表4。氟虫腈及其代谢物在0.1～20.0 ng/mL线性关系良好，r值均大于0.999。

2.5 方法检出限

最低检出限按最低浓度点1.0 ng/g的响应值与基线的噪声响应的3倍计算，检出限结果见表4。氟虫腈及其代谢物的方法检出限为0.010～0.023 ng/g，能满足动物源性食物中微量氟虫腈及其代谢物的检测。

2.6 方法回收率和精密度

在相同的试验条件下，分别对6个空白禽肉、禽蛋样品添加浓度为2.0、10.0、20.0 ng/g的氟虫腈及其代谢物混合标样，进行加标回收和精密度测试，测试结果见表4。氟虫腈及其代谢物的加标回收率为94.9%～113.0%，相对标准偏差为1.9%～4.9%，可见该方法具有很好的回收率和精密度。

3 结论

该试验采用QuEChERS-EMR前处理，提取效率高，操作简便快捷，且有机溶剂用量少，对环境友好;使用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术，建立了动物源性食物中氟虫腈及其代谢物的检测方法，整个分析过程简单快捷，大大减少人为误差，检测方法的准确性好、精密度高，适合于动物源性食物中氟虫腈及其代谢物的快速检测。

参考文献

[1] AMRITH S.Gunasekara & tresca troung[M]//GUNASEKARA A S，TROUNG T.Environmental fate of fipronil.California Environmental Protection Agency，2007.

[2] 農业部.农业部公告 第1157号（加强氟虫腈管理的有关事项公告）[A].2009.

[3] WHO：Pesticide Residues in Food1997：Fipronil;International Programme on Chemical Safety[S].Lyon：World Health Organization，1997.

[4] HAINZL D，CASIDA J.Fipronil insecticide：Novel photochemical desulfinylation with retention of neurotoxicity[J].Proceedings of the national academy of sciences，1996，93（23）：12764-12767.

[5] National Pesticide  Information Center.Fipronil technical fact sheet[Z].2015-12-07.

[6] Eggs containing fipronil found in 15 EU countries and Hong Kong[R].BBC News，2017-08-11.

[7] Eggs at 44 farms in Taiwan found with excessive insecticide levels[R].Taiwan News，2017-08-26.

[8] 国家卫生计生委.食品中农药最大残留限量：GB 2763—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[9] 吕冰，尹帅星，陈达炜，等.QuEChERS-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定动物性食品中氟虫腈及其代谢物残留[J].分析测试学报，2017，36（12）：1424-1430.

[10] 励炯，郑锌，王红青，等.分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定禽蛋中氟虫腈及其代谢产物[J].色谱，2017，35（12）：1211-1215.

[11] 时逸吟，李优，伊雄海，等.液相色谱-串联质谱法测定蛋及蛋制品中氟虫腈及其代谢物的残留量[J].检验检疫学刊，2017，27（5）：1-7.

[12] 刘善菁，刘雨昕，陆桂萍，等.液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱测定鸡蛋及鸡肉中氟虫腈及其代谢物残留的研究[J].中国兽药杂志，2017，51（10）：29-38.

[13] 郭德华，时逸吟，李优，等.固相萃取-液相色谱-四极杆飞行时间质谱法快速筛查禽蛋及蛋制品中氟虫腈及其代谢物[J].色谱，2017，35（12）：1216-1223.