UPLC法测定水产品中磺胺类药物改进

陈永平+张素青+李连庆+李春青+马丹+高丽娜+张萍

DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.02.008

摘 要：改进了水产品中磺胺类药物测定-超高效液相色谱法。样品经乙酸乙酯提取、流动相稀释后进高效液相色谱仪进行检测分析。色谱条件：ACQUITY UPLC HSS T3( 1.8 μm，2.1×100 mm) 色谱柱，流动相为甲醇与0.2%甲酸水，检测波长范围270 nm，柱温40 ℃，进样量为4 μL，磺胺类药物在0.01～0.5 μg/mL范围内呈良好的线性关系。该方法简便、准确，可以准确地判断水产品中磺胺类药物，并进行定量计算。

关键词：磺胺类药物；超高效液相色谱；水产品

磺胺类药物是常用的广谱抗菌药[1]。因其具有抗菌谱广、高效、低毒和价格低廉等特点，在动物养殖中被广泛使用。人类经常食用有磺胺类药物残留的动物源性食品，可能引起磺胺类药物在体内的逐渐累积。其危害性主要表现为细菌耐药性、过敏、造血紊乱、致癌作用等[2-3]。目前中国、欧盟、美国、日本等均将磺胺类药物列为动物饲养过程中限制使用的药物，最大残留限量一般为50～100 μg/kg。测定动物组织中磺胺类药物的分析方法较多，包括毛细管电泳法，液相色谱法，气相色谱法，液相色谱-质谱法等[4-9]，应用最广泛的主要为液相色谱法和液相色谱质谱法。有些方法前处理复杂，上机分析时间较长或成本较高影响了实验效率。本研究通过优化流动相、前处理提取试剂，建立的方法具有提取简单、净化速度快、实验周期短、回收率高、价格低廉等优点，可以满足检测需求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器设备Waters UPLC 超高效液相色谱，二极管阵列检测器，Empower2 色谱工作站（购自Waters科技有限公司）；MILIPORE超纯水器；METTLER XP205 电子天平（梅特勒-托利多公司，0.001 g），旋涡混合器（上海康华仪器制造厂），均质器（飞利浦公司，转速10 000 r/min），离心机(Sigma公司，旋转蒸发仪。

乙酸乙酯(TEDIA)、甲醇(TEDIA)、正己烷(TEDIA)、异丙醇(TEDIA)均为色谱纯，甲酸(优级纯)，超纯水。

磺胺标准品:磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺多辛、磺胺异噁唑、磺胺喹噁啉，纯度均不小于98.0%。

标准储备液：称取各磺胺标准品10 mg(精确至0.01 mg)，用甲醇分别溶解并定容至10 mL，各磺胺标准储备液浓度为1 000 mg/L。避光4 ℃冷藏保存，保存期为1个月。

混合标准中间液：适量移取各标准储备液，用甲醇稀释并定容至10 mL，在室温下混匀。其中磺胺嘧啶10 mg/L、磺胺噻唑10 mg/L、磺胺甲基嘧啶10 mg/L、磺胺二甲基嘧啶10 mg/L、磺胺甲基异噁唑20 mg/L、磺胺多辛20 mg/L、磺胺异噁唑20 mg/L、磺胺喹噁啉20 mg/L。避光4 ℃冷藏保存，保存期为1周。

混合标准使用液：取混合标准中间液1.25 mL，用流动相稀释并定容至100 mL。现配现用。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 鱼，去鳞、去皮，沿脊背取肌肉；虾，去头、去壳、去肠线，取肌肉部分；样品切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块后混合。

1.2.2 提取 将样品解冻，称取5.00 g，置于50 mL玻璃离心管。然后加入25 mL乙酸乙酯，超声1 min，均质机14 000 r/min均质1 min，漩涡混匀1 min，9 000 r/min离心5 min，将乙酸乙酯过无水硫酸钠柱到100 mL梨形瓶中。再向原离心管中加入25 mL乙酸乙酯，旋涡混匀1 min，9 000 r/min离心5 min，将乙酸乙酯层过无水硫酸钠合并于100 mL梨形瓶中，清洗液合并于梨形瓶中于40 ℃水浴中减压浓缩至近干，先加入1 mL流动相，再加入2 mL正己烷，涡旋1 min，转移至离心管中4 000 r/min离心3 min，弃正己烷，底层过0.25 μm滤膜，待上机。

1.2.3 色谱条件ACQUITY UPLC HSS T3 ( 1.8 μm，2.1×100 mm) 色谱柱；检测波长：270 nm，柱温40 ℃，进样量为4 μL；流动相A 相:0.2%甲酸水溶液，B 相: 甲醇，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱条件

时间/min 流速/mL•min-1 A% B%

初始 0.4 80 20

0.500.4 80 20

3.200.4 70 30

5.500.4 30 70

6.000.4 80 20

7.000.4 80 20

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

试验分别采用乙腈与乙酸铵溶液、甲醇与乙酸铵溶液、甲醇与0.1%甲酸水、甲醇与0.2%甲酸水作为流动相，实验结果表明：甲醇与0.2%甲酸水流动相系统梯度洗脱，各组分色谱峰型、响应值与分离度最好。实验选择甲醇与0.2%甲酸水作为流动相，梯度洗脱，7 min即可完成分析。

2.2 样品提取条件的选择

试验分别采用乙腈-氯仿（10∶1）、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈作为提取剂，实验结果表明：采用乙酸乙酯作为提取剂各组分回收率均在80%～120%之间，回收效果明显好于其他提取剂，杂质干扰小，各组分分离度好。所以本方法选择乙酸乙酯作为提取剂。

2.3 方法的线性范围和检出限

图1 8种磺胺标准图

图2 鱼样空白色谱图

图3 鱼肉样品添加色谱图

0.2%甲酸水-甲醇( 80: 20) 将标准溶液分别配制成外标浓度为10.0，20.0，50.0，100.0，200.0，500.0 ng/mL的标准工作液进样分析，以外标浓度为横坐标，响应值为纵坐标，绘制得8种磺胺的标准曲线线性良好，其相关系数在0.998 0～0.999 9 之间。方法检出限( LOD) 以空白样品基质稀释标准曲线上的最低浓度出峰时，取信噪比S/N＝3 计算得出10.0 μg/kg。定量限( LOQ) 是以空白样品基质稀释标准曲线上的最低浓度出峰时，取信噪比S/N＝10 计算得出25 μg/kg。

2.4 添加回收率验证

取空白鱼样品分别向其中加入50 μg/kg、100 μg/kg 和200 μg/kg 浓度的磺胺类药物混合标准溶液。进行提取、净化及色谱分析。每个添加水平作5 份平行测定，结果表明: 平均回收率为78.5%～95.7%，相对标准偏差为2.8%～10.3%，结果见表2。

试验结果表明，用超高效液相色谱－二极管阵列检测器检测水产品中磺胺类药物，灵敏度高，检测限低，线性、回收率均符合标准要求。

表2 试样加标回收率和重复测定的相对标准偏差

添加浓度/

μg•kg-1 测定参数/% 磺胺嘧啶 磺胺噻唑 磺胺甲

基嘧啶 磺胺二甲

基嘧啶 磺胺甲基

异噁唑 磺胺

多辛 磺胺

异噁唑 磺胺喹

噁啉

50 平均回收率

RSD 81.2

4.4 85.4

3.5 79.7

2.8 86.3

5.2 82.2

4.7 78.5

4.5 87.1

5.6 84.6

6.4

100 平均回收率

RSD 85.5

5.9 89.3

4.2 83.3

6.5 91.6

7.3 85.4

5.4 83.7

9.6 92.4

8.3 89.2

3.9

200 平均回收率

RSD 89.5

5.3 93.3

7.1 90.3

8.8 94.6

4.5 88.4

6.5 85.9

10.3 80.8

5.7 95.7

6.3

参考文献：

[1] 白丽丽，戴华，林正峰.高效液相色谱- 串联质谱法检测虾中9 种磺胺类药物的残留[J].药品鉴定，2011,18（23）:60-62

[2] 段振娟,张鸿雁,王硕.动物性食品中磺胺类药物残留分析研究进展[J].食品研究与开发,2007,28(6):149-152

[3] 万春花,龙洲雄.磺胺类药物残留的色谱分析进展[J].现代科学仪器,2008,18(2):99-104

[4] 游辉,于辉,武颜文,等.快速溶剂萃取-高效液相色谱法同时测定牛肉中5 种磺胺类药物残留[J].化学通报,2010,73(9):854-857

[5] 刘正才,杨方,余孔捷,等.超高效液相色谱-串联质谱法快速检测鳗鱼中磺胺类、喹诺酮类、四环素族抗生素药物残留[J].食品科学,2009,30(14):167-170

[6] 李玉琴,张传港,宗素艳,等.高效毛细管电泳法测定磺胺类药物的离解常数及其制剂的含量[J].药物分析杂志,2008,28(2):243～246

[7] 黄德凤,戚隽渊,孙建华,等.高效液相色谱—串联质谱法同时测定水产品中19种磺胺类药物残留量[J].水产科技情报,2012,40(3):148-151

[8] 吴淑秀，公茂金，朱万燕,等.液相色谱串联质谱法测定猪肉和猪肝中9种磺胺类药物的残留[J].分析试验室, 2012, 31（2）:79-83

[9] 傅宏庆，王颖，张丹,等.高效液相色谱—紫外法对13种磺胺类药物的同步检测[J].中国畜牧兽医2012, 39（4）:233-237

Improvement of determination of sulfa drugs residues in

aquatic products by UPLC method

CHEN Yong

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Ping, ZHANG Su

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Qing, LI Lian

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Qing,

LI Chun

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Qing, MA Dan，GAO Li

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Na,ZHANG Ping

(Super ision and test Center for f isheries Environment and Quality of f ishery products of Ministry Ag riculture Tian Jin 300221)

Abstract：A method of UPLC-PDA for determination of sulfonamides in Aquatic products was developed.The liquid chromatography separation was carried on ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm,2.1×100 mm) with Methanol-0.2% Formic acidsystem as mobile phase.The wavelength range was 270 nm.The calibration curve was linear in the range of 0.01～0.5 μg/mL.The method was simple, and would accurately determine sulfonamides in in Aquatic products．

Key words：sulfonamides;UPLC;Aquatic products

（收稿日期：2013-11-24）

本刊为北京万方数据股份有限公司、万方数据电子出版社，中国学术期刊（光盘版）电子杂志社，中文科技期刊数据库，中国核心期刊（遴选）数据库入选期刊，并由其对外提供信息服务，相关著作权使用费和稿费由本刊一并支付，如有异议，请在来稿时注明，本刊将作适当处理。《河北渔业》编辑部

基嘧啶 磺胺甲基

异噁唑 磺胺

多辛 磺胺

异噁唑 磺胺喹

噁啉

50 平均回收率

RSD 81.2

4.4 85.4

3.5 79.7

2.8 86.3

5.2 82.2

4.7 78.5

4.5 87.1

5.6 84.6

6.4

100 平均回收率

RSD 85.5

5.9 89.3

4.2 83.3

6.5 91.6

7.3 85.4

5.4 83.7

9.6 92.4

8.3 89.2

3.9

200 平均回收率

RSD 89.5

5.3 93.3

7.1 90.3

8.8 94.6

4.5 88.4

6.5 85.9

10.3 80.8

5.7 95.7

6.3

参考文献：

[1] 白丽丽，戴华，林正峰.高效液相色谱- 串联质谱法检测虾中9 种磺胺类药物的残留[J].药品鉴定，2011,18（23）:60-62

[2] 段振娟,张鸿雁,王硕.动物性食品中磺胺类药物残留分析研究进展[J].食品研究与开发,2007,28(6):149-152

[3] 万春花,龙洲雄.磺胺类药物残留的色谱分析进展[J].现代科学仪器,2008,18(2):99-104

[4] 游辉,于辉,武颜文,等.快速溶剂萃取-高效液相色谱法同时测定牛肉中5 种磺胺类药物残留[J].化学通报,2010,73(9):854-857

[5] 刘正才,杨方,余孔捷,等.超高效液相色谱-串联质谱法快速检测鳗鱼中磺胺类、喹诺酮类、四环素族抗生素药物残留[J].食品科学,2009,30(14):167-170

[6] 李玉琴,张传港,宗素艳,等.高效毛细管电泳法测定磺胺类药物的离解常数及其制剂的含量[J].药物分析杂志,2008,28(2):243～246

[7] 黄德凤,戚隽渊,孙建华,等.高效液相色谱—串联质谱法同时测定水产品中19种磺胺类药物残留量[J].水产科技情报,2012,40(3):148-151

[8] 吴淑秀，公茂金，朱万燕,等.液相色谱串联质谱法测定猪肉和猪肝中9种磺胺类药物的残留[J].分析试验室, 2012, 31（2）:79-83

[9] 傅宏庆，王颖，张丹,等.高效液相色谱—紫外法对13种磺胺类药物的同步检测[J].中国畜牧兽医2012, 39（4）:233-237

Improvement of determination of sulfa drugs residues in

aquatic products by UPLC method

CHEN Yong

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Ping, ZHANG Su

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Qing, LI Lian

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Qing,

LI Chun

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Qing, MA Dan，GAO Li

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Na,ZHANG Ping

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Abstract：A method of UPLC-PDA for determination of sulfonamides in Aquatic products was developed.The liquid chromatography separation was carried on ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm,2.1×100 mm) with Methanol-0.2% Formic acidsystem as mobile phase.The wavelength range was 270 nm.The calibration curve was linear in the range of 0.01～0.5 μg/mL.The method was simple, and would accurately determine sulfonamides in in Aquatic products．

Key words：sulfonamides;UPLC;Aquatic products

（收稿日期：2013-11-24）

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基嘧啶 磺胺甲基

异噁唑 磺胺

多辛 磺胺

异噁唑 磺胺喹

噁啉

50 平均回收率

RSD 81.2

4.4 85.4

3.5 79.7

2.8 86.3

5.2 82.2

4.7 78.5

4.5 87.1

5.6 84.6

6.4

100 平均回收率

RSD 85.5

5.9 89.3

4.2 83.3

6.5 91.6

7.3 85.4

5.4 83.7

9.6 92.4

8.3 89.2

3.9

200 平均回收率

RSD 89.5

5.3 93.3

7.1 90.3

8.8 94.6

4.5 88.4

6.5 85.9

10.3 80.8

5.7 95.7

6.3

参考文献：

[1] 白丽丽，戴华，林正峰.高效液相色谱- 串联质谱法检测虾中9 种磺胺类药物的残留[J].药品鉴定，2011,18（23）:60-62

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[4] 游辉,于辉,武颜文,等.快速溶剂萃取-高效液相色谱法同时测定牛肉中5 种磺胺类药物残留[J].化学通报,2010,73(9):854-857

[5] 刘正才,杨方,余孔捷,等.超高效液相色谱-串联质谱法快速检测鳗鱼中磺胺类、喹诺酮类、四环素族抗生素药物残留[J].食品科学,2009,30(14):167-170

[6] 李玉琴,张传港,宗素艳,等.高效毛细管电泳法测定磺胺类药物的离解常数及其制剂的含量[J].药物分析杂志,2008,28(2):243～246

[7] 黄德凤,戚隽渊,孙建华,等.高效液相色谱—串联质谱法同时测定水产品中19种磺胺类药物残留量[J].水产科技情报,2012,40(3):148-151

[8] 吴淑秀，公茂金，朱万燕,等.液相色谱串联质谱法测定猪肉和猪肝中9种磺胺类药物的残留[J].分析试验室, 2012, 31（2）:79-83

[9] 傅宏庆，王颖，张丹,等.高效液相色谱—紫外法对13种磺胺类药物的同步检测[J].中国畜牧兽医2012, 39（4）:233-237

Improvement of determination of sulfa drugs residues in

aquatic products by UPLC method

CHEN Yong

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Ping, ZHANG Su

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Qing, LI Lian

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Qing,

LI Chun

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Qing, MA Dan，GAO Li

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Na,ZHANG Ping

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Abstract：A method of UPLC-PDA for determination of sulfonamides in Aquatic products was developed.The liquid chromatography separation was carried on ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm,2.1×100 mm) with Methanol-0.2% Formic acidsystem as mobile phase.The wavelength range was 270 nm.The calibration curve was linear in the range of 0.01～0.5 μg/mL.The method was simple, and would accurately determine sulfonamides in in Aquatic products．

Key words：sulfonamides;UPLC;Aquatic products

（收稿日期：2013-11-24）

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