QuEChERS-气相色谱质谱联用法测定辣椒中的咪鲜胺及2，4，6-三氯苯酚残留量

张彦军，洪霞，钱滢文，*，王克辉，熊敏晖，王燕娇，马燕，尚欣春

（1.甘肃省商业科技研究所有限公司，甘肃 兰州 730010；2.甘肃中商食品质量检验检测有限公司，甘肃 兰州 730010）

辣椒是世界上仅次于豆类、番茄的第三大蔬菜作物，在我国种植规模大、产品类别多样、市场需求高，是我国最大的蔬菜产业。辣椒中含有丰富的辣椒红素、辣椒素、维生素、矿物质等，具有很高的保健功能和营养价值，有抗菌消炎、抗氧化、降低胆固醇、溶解血栓等方面的功效能增，为重要的蔬菜和调味品[1-2]。

咪鲜胺是一种咪唑类广谱高效杀菌剂，其作用机理主要通过抑制麦角甾醇的生物合成，破坏细胞膜结构功能，从而达到杀菌目的，对辣椒枯萎病菌引起病害具有很好的保护和治疗作用，用于防治辣椒的枯萎病[3-4]。咪鲜胺在环境中首先降解为N-丙基-N-[2-（2，4，6-trichlorophenol，2，4，6-三氯苯氧基）乙基]脲（BTS44595）和 N-醛基-N-丙基-N-[2-（2，4，6-三氯苯氧基）乙基]脲（BTS44596），后降解为 BTS45186[5-6]，即 2，4，6-三氯苯酚（2，4，6-TCP）。根据国内外研究咪鲜胺的毒性[7]，咪鲜胺毒性较低，在推荐使用剂量范围内，其对哺乳动物的致突变作用、致癌作用以及致畸作用的危害较小。但2，4，6-TCP 作为咪鲜胺的最终降解物，已经被确定为我国水体中的优先污染物，是一种具有毒性、致突变性和致癌性的环境污染物，会对人类的健康造成潜在威胁[8]，其残留问题受到越来越多的关注。

国内外对于咪鲜胺和2，4，6-TCP 检测的前处理，样品提取液在210 ℃～240 ℃条件下与吡啶盐酸盐发生水解反应，将咪鲜胺及其代谢物全部转化为2，4，6-TCP，经石油醚提取后采用磺化法净化，检测2，4，6-TCP 的含量[9-11]。该方法操作复杂费时，且吡啶盐酸盐毒性较大，对试验人员的健康和环境安全造成威胁。QuEChERS（quick、easy、cheap、effective、rugged、safe）为这一问题提供了新的解决途径，该方法利用N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）去除组份中的色素和油脂，以无水硫酸镁去除水分，适用于辣椒中咪鲜胺和2，4，6-TCP 农药残留的提取和净化，是一种快速、简单、便宜、可靠和安全的样品前处理方法[12]。目前，对咪鲜胺和2，4，6-TCP 的检测方法有气相色谱法（gas chromatography，GC）[13]，液相色谱法（lliquid chromatography，LC）[14]，气相色谱-质谱联用法（gas chromatogarphy-mass spectrometry，GC-MS）[15]，液相色谱-质谱联用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[16-17]等，主要涉及到样品有水果[18]、谷物[19]、油料作物[20]、中药材[21]和土壤[22]等，而对辣椒中咪鲜胺和2，4，6-TCP 残留的研究尚无报道。

本文建立了QuEChERS-气相色谱-质谱连用测定辣椒中咪鲜胺和2，4，6-TCP 残留的方法，具有对咪鲜胺和2，4，6-TCP 精密度好、准确度高、溶剂使用量少、样品制备过程简单和分析成本廉价的优点。能够对低浓度的咪鲜胺和2，4，6-TCP 进行定性与定量分析，填补了辣椒中咪鲜胺和2，4，6-TCP 残留检测研究中的空白。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无水硫酸镁（分析纯，使用前650 ℃下灼烧4 h，备用）：天津市凯信化学工业有限公司；乙酸钠（分析纯）：天津市光复精细化工研究院；PSA：天津博纳艾杰尔科技有限公司；冰乙酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯）：北京百灵威科技有限公司；甲醇中咪鲜胺溶液标准物质（25165XM，纯度98.4%，浓度为 100 μg/mL）、甲醇中 2，4，6-TCP 溶液标准物质（26233XM，纯度 99.5 %，浓度为 100 μg/mL）：北京振翔科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C 气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦科技有限公司；VORTEX genius3 涡旋混合器：艾卡（广州）仪器设备有限公司；RJ-TDL-60B 离心机：无锡市瑞江分析仪器有限公司；JJ500 电子天平：常熟市双杰测试仪器厂。

1.3 条件

1.3.1 气相色谱条件

DB-1701 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度260℃；升温程序：初始温度60℃保持1 min，以 10 ℃/min 升至 280 ℃，保持 10 min；进样量 1.0 μL，不分流进样。

1.3.2 质谱条件

EI 电离源，电离电压70 eV；离子源温度280 ℃；传输线温度280 ℃；溶剂延迟：5 min；咪鲜胺选择监测离子：定量离子 m/z 180；定性离子 m/z 308、266。2，4，6-TCP 选择监测离子：定量离子 m/z 196；定性离子 m/z 198、132。

1.4 样品处理

称取10.00 g 样于50 mL 离心管，加10 mL 乙腈-乙酸（99 ∶1，体积比），摇匀，加 3.0 g 无水硫酸镁，1.0 g乙酸钠，涡旋1 min，4 000 r/min 离心5 min。取上清液5 mL 于15 mL 离心管，加1.0 g 无水硫酸镁PSA量（3 ∶1，质量比），涡旋 1 min，4 000 r/min 离心 5 min，取1 mL 上清液过膜，待测。

1.5 标准溶液的配制

分别准确移取 1 mL 100 μg/mL 的咪鲜胺和2，4，6-TCP 标准品溶液至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配成两种10.0 μg/mL 的标准储备液，分别吸取以上两种标准储备液适量，并用样品提取液稀释至质量浓度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL 系列混合标准溶液。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

选用丙酮、乙腈、乙腈-乙酸作为提取溶剂进行比较。在辣椒中添加 0.1 μg/mL 咪鲜胺和 2，4，6-TCP 标准溶液测定其回收率见表1。

表1 辣椒中咪鲜胺和2，4，6-TCP 在0.1 μg/mL 添加水平下的回收率及其相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）Table 1 Recoveries and the relative standard deviation（RSD）of prochloraz and 2，4，6-TCP at 0.1 μg/mL spiked in pepper

由表1可知，咪鲜胺在丙酮、乙腈、乙腈-乙酸中回收率在94.55%～105.55%之间，三者对咪鲜胺均有较好的提取效果。2，4，6-TCP 在丙酮和乙腈中回收率为79.27 %～87.72 %之间，在乙腈-乙酸中回收率为96.92%～105.25%，说明 2，4，6-TCP 在乙腈-乙酸提取效率比乙腈好。这是由于2，4，6-TCP 具有较强的极性和酸性，其羟基上的H+与环境中的Na+进行交换从而生成 2，4，6-三氯苯酚钠，而 2，4，6-三氯苯酚钠在水相中的溶解度大于在有机相中的溶解度，有机相无法对样品基质中的2，4，6-三氯苯酚钠进行有效提取，加入乙腈-乙酸，存在大量的H+，促进样品基质中2，4，6-三氯苯酚钠形成 2，4，6-TCP，从而提高提取效率，2，4，6-TCP 与 2，4，6-三氯苯酚钠的转化见图1。

图1 2，4，6-TCP 与 2，4，6-三氯苯酚钠的转化Fig.1 The transformation of 2，4，6-TCP and 2，4，6-trichlorophenosodiumsalt

因此，本研究选择乙腈-乙酸作为咪鲜胺和2，4，6-TCP 的提取剂。

2.2 无水硫酸镁PSA用量的优化

本研究选用无水硫酸镁PSA 量净化提取液，PSA对多糖、肽类（包括氨基酸）和色素有强吸附作用，无水硫酸镁去除提取液中少量的水分，有助于加强PSA的净化效果。考察不同用量的无水硫酸镁PSA 量对净化效率的影响见表2，按1.4 过程在辣椒中添加0.10 μg/mL 咪鲜胺和 2，4，6-TCP 混合标准溶液，分别以 0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 g 无水硫酸镁 PSA 量净化提取液，观察不同用量的无水硫酸镁PSA 对提取液的净化效果。试验结果显示，随3 ∶1 的无水硫酸镁PSA 用量增加对提取液净化效果越好。

表2 辣椒中在0.10 μg/mL 添加水平下不同量3 ∶1 的无水硫酸镁PSA 对平均回收率的影响（n=5）Table 2 Effects of amount of anhydrous magnesium sulfate PSA（3 ∶1，m/m）on average recoveries of 0.10 μg/mL spiked in pepper（n=5）

由表2可知，当无水硫酸镁和PSA 的量达到1.0 g后2，4，6-TCP 和咪鲜胺回收率基本不变。综合净化效果和回收率，本研究选择1.0 g 无水硫酸镁PSA 量净化提取液。

2.3 线性范围和检出限

取1.4 配制的咪鲜胺和2，4，6-TCP 标准混合工作液，在最佳的试验条件下检测咪鲜胺和2，4，6-TCP，以进样质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标见图2。

图2 咪鲜胺和2，4，6-TCP 标准曲线Fig.2 The standard curve of the prochloraz and 2，4，6-TCP

得到咪鲜胺和2，4，6-TCP 的线性方程分别为Y=637 497.3X-8 786.1 和 Y=890 775.9X-3 978.6，其相关系数r 值分别为0.999 1 和0.999 2，表明咪鲜胺和2，4，6-TCP 在 0.01 μg/mL～1.0 μg/mL 范围内的线性关系均良好，以3 倍信噪比（S/N=3）确定咪鲜胺和2，4，6-TCP 检出限为 0.003 3 mg/kg，满足残留定量分析要求。

2.4 回收率和精密度

试验对辣椒进行了加标回收试验，考察该方法的回收率与精密度。按照1.5 步骤对辣椒添加0.02、0.10、0.50 μg/mL 3 个水平的咪鲜胺和 2，4，6-TCP 标准溶液，经前处理后GC-MS 分析，测定后计算回收率见表3。

表3 辣椒中咪鲜胺和2，4，6-TCP 在3 个添加水平下的平均回收率及其相对标准偏差（n=7）Table 3 Average recoveries and the RSD of prochloraz and 2，4，6-TCP at three spiked levels in pepper（n=7）

由表3可知，在3 个添加水平下咪鲜胺和2，4，6-TCP 的平均回收率在96.70%～100.64%的范围之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）介于2.33%～4.28%之间，表明此方法具有较高的准确度和精密度。因此，试验中开发的方法满足2，4，6-TCP 和咪鲜胺分析的要求，可用于辣椒样品中2，4，6-TCP 和咪鲜胺农药残留的检测。

2.5 实样分析

利用本试验方法按1.5 样品处理步骤，以市售的辣椒50 个样品进行定性定量分析见表4。

其中 4 个样品检出咪鲜胺和 2，4，6-TCP 残留，结果见表4，其余样品均未检出，对检出样品做5 次平行检测，咪鲜胺和2，4，6-TCP 分别在0.049 mg/kg～0.25 mg/kg 和 0.018 mg/kg～0.19 mg/kg 之间，相对标准偏差在6.02%～11.28%之间。

表4 实样检测结果Table 4 Sample test results

由于咪鲜胺最终降解为2，4，6-TCP，根据水解反应的化学计量法，1 摩尔咪鲜胺（分子量为376.7）水解产生 1 摩尔的 2，4，6-TCP（分子量为 197.5），所以它们之间存在下一种转换关系[23-24]：

1（mg/kg）2，4，6-TCP=1.907（mg/kg）咪鲜胺

按照GB2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量规定》[25]，咪鲜胺及其含有2，4，6-三氯苯酚部分的代谢产物之和，以咪鲜胺表示，根据转换关系计算4 个样品中咪鲜胺的含量在0.095 mg/kg～0.57 mg/kg 之间，在辣椒中的最终残留量均低于最大残留量2 mg/kg。

3 结论

采用QuEChERS-气相色谱-串联质谱法对蔬菜中咪鲜胺及其代谢物2，4，6-三氯苯酚残留量的检测技术进行了研究。该方法前处理简便快速、选择性好、灵敏度高、抗干扰能力强，具有良好的线性响应，且在0.02、0.10、0.50 μg/mL 添加水平下，两种农药均有较好的回收率。表明该方法符合农药残留分析的要求，适用于辣椒中咪鲜胺及其代谢物2，4，6-三氯苯酚残留检测的定性和定量分析。