基于响应曲面优化的毛细管电泳测定通经草中的芦丁和异槲皮苷

2019-08-27桑志国吕元琦

食品与药品 2019年4期

袁哲，桑志国，孙姗，吕元琦*

（1.济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院，山东济南 250200；2.山东省医学科学院药物研究所，山东济南 250062；3.国家卫生部生物技术药物重点实验室，山东省罕少见病重点实验室，山东济南250062；4.德州学院分析测试中心，山东德州 253023）

通经草又名铜丝草、金丝草等，是中国蕨科粉背蕨属银粉背蕨[Aleuri-topteris argentea(Gmel.) Fée]的干燥全草[1]，具有活血调经、止咳、利湿、解毒消肿等功效[2]，在我国藏族、蒙古族和朝鲜族等少数民族地区应用比较普遍。药理研究证实通经草具有抗炎功效且其药理作用主要与黄酮类组分有关[3]。芦丁和异槲皮苷是通经草中两种黄酮类活性成分[4]，准确测定通经草中的芦丁和异槲皮苷对其质量控制有重要意义。毛细管电泳具有分析速度快，分辨率高和分析成本低等优点[5-6]，已成为发展较快的分析方法之一。响应曲面法（response surface method，RSM）采用多元二次回归方程来拟合响应值与各因素间的函数关系[7-8]，将试验体系的目标响应值作为单个或多个因素的函数，将函数关系通过立体或多维图形显示出来，结合图形分析、函数求导等方法优化试验条件。其具有试验次数少、周期短、求得的回归方程精度高等优点。本文采用RSM优化芦丁和异槲皮苷的毛细管电泳分离条件，建立了一种毛细管电泳分析通经草中芦丁和异槲皮苷的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

K1050高效毛细管电泳仪（北京凯奥），配有高压电源和可变波长紫外检测器；未涂层石英毛细管柱（河北永年光导纤维厂）；PHSJ-4A 酸度计（上海精密仪器公司）。

1.2 试药

芦丁（对照品，纯度≥97 %，美国Sigma-Aldrich公司）；异槲皮苷（对照品，纯度≥98 %，美国Sigma-Aldrich公司）；硼砂（纯度≥99.5 %，美国Sigma-Aldrich公司）；硼酸（纯度≥99.5 %，美国Sigma-Aldrich公司）；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（BMIM-PF6，纯度≥98 %，英国Alfa-Aesar公司）；其他试剂均为分析纯，实验用水为二次石英蒸馏水（DDW），不同产地通经草（购自河北安国中药市场）。

2 方法

2.1 电泳条件

以pH 8.7的23 mmol/L硼砂-1.0 mol/L硼酸-5.34 mmoL/L BMIM-PF6为工作缓冲溶液，工作电压18 kV，温度25 ℃，压差进样（高度11.5 cm，进样时间15 s），检测波长354 nm。新毛细管使用前依次用DDW，1 mol/L NaOH，DDW和缓冲液依次冲洗30，30，15，15 min。每天实验前，依次用DDW，1 mol/LNaOH，DDW和缓冲液冲洗15，15，10，10 min。为保证迁移时间和峰面积的重现性，每两次进样之间，分别用DDW，1 mol/LNaOH，DDW，缓冲液各冲洗5 min。所有溶液在进样前，均经超声脱气5 min，上机前用0.22 μm醋酸纤维滤膜过滤。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备分别准确称取芦丁、异槲皮苷对照品各2.0 mg，用乙醇溶解至2 ml，得1 mg/ml芦丁、异槲皮苷对照品母液。使用时用70 %（v/v）乙醇稀释至所需浓度。

2.2.2 供试品溶液的制备将通经草在阳光下晒干，60 ℃鼓风干燥6 h，粉碎，过80目筛。准确称取样品0.250 g，加70 %乙醇35 ml，超声1 h，60 ℃水浴加热30 min，醇沉过夜，滤过，取滤液，70 %乙醇定容至50 ml。

2.3 线性关系

以浓度（μg/ml）为横坐标，分析物峰面积（mAU·s）为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明芦丁和异槲皮苷的浓度和峰面积分别在2～200，2～250 μg/ml范围内线性关系良好，芦丁和异槲皮苷线性回归方程分别为：y=699.99x-29.106，R2=0.9999；y=1703.8x+76.602，R2=0.9996。

2.4 精密度实验

取10 μg/ml混合对照品溶液，按2.1项条件进样测定，连续测定5次，2种分析物迁移时间和峰面积的RSD分别为1.67 %，1.27 %和2.80 %，2.69 %。芦丁和异槲皮苷基于3倍噪音法的检出限分别为0.6，0.4 μg/ml。

2.5 单因素实验

硼酸盐缓冲体系常被用来分离黄酮类化合物，选择硼砂缓冲溶液作为工作缓冲溶液。离子液体可提高毛细管电泳分离能力，本文选择BMIMPF6离子液体作为添加剂。分别在pH 7.0～9.5、15～40 mmol/L、12～18 kV，1.47～7.28 mmol/L范围内研究了缓冲溶液pH值、缓冲溶液浓度、工作电压和离子液体BMIM-PF6浓度对分离的影响。综合考虑分离度和分析时间，选择缓冲溶液浓度为25 mmol/L，缓冲溶液pH为8.5，工作电压为17 kV，离子液体BMIM-PF6浓度为6.31 mmol/L。最佳条件下分析物的分离情况见图1，由图1可见，芦丁和异槲皮苷并未实现基线分离。

图1 单因素实验优化分离条件下混合对照品溶液毛细管电泳图

2.6 RSM优化实验结果

在单因素实验结果的基础上，以芦丁与异槲皮苷的分离度R（Y）为响应值，选取对分离度影响显著的4个因素即缓冲溶液pH（A）、工作电压（B）、缓冲溶液浓度（C）和BMIM-PF6浓度（D），采用四因素三水平试验设计进行Box-Behnken中心组合试验，RSM设计因素水平及编码见表1。

表1 RSM设计因素水平及编码

根据表1的设计因素水平及编码，利用Box-Behnken中心组合实验原理进行试验设计，设计方案及结果见表2。利用 Design-Expert 8.0 软件对表2中数据进行二次多项式回归拟合，得分离度R（Y）与各自变量的二次多元回归方程Y=2.59-0.012A-0.0033B-0.0075C+0.0083D+0.27AB+0.023AC+0.0075AD+0.072BC+0.005BD+0.048CD-0.40A2-0.350B2-0.37C2-0.34D2，回归方程分析见表3。

表2 RSM试验设计方案与结果

由表3可见，模型有很高的显著性（P＜0.0001）；失拟项P＞0.05，说明模型失拟度不显著。R2=0.9896，表明所选取的模型相关度较好，可行性强。由F值可得各个因素对芦丁与异槲皮苷分离度影响的大小顺序：缓冲溶液pH（A）＞BMIM-PF6浓度（D）＞缓冲溶液浓度（C）＞工作电压（B）。

采用Design-Expert 8.0软件对缓冲溶液pH（A）、工作电压（B）、缓冲溶液浓度（C）和BMIM-PF6浓度（D）各因子间的交互作用进行分析，结果见图2。响应面三维图不仅可解释自变量之间的相互作用，也可反映变量间的相互作用。通过观察曲面的弯曲度确定两者对响应值的影响程度，弯曲度越高，即坡度越陡，说明两者交互作用越显著[9]。由图2可见，缓冲溶液浓度（C）与BMIM-PF6浓度（D）两因素交互作用的响应面较陡，表明缓冲溶液浓度（C）与BMIM-PF6浓度（D）两因素交互作用显著。

表3 回归方程方差分析

图2 各因素交互作用对芦丁与异槲皮苷分离度影响的响应面分析

2.7 最佳分离条件及验证实验

采用Design-Expert 8.0软件对极值进行求解分析，得最佳分离条件为pH 8.67，工作电压17.72 kV，缓冲溶液浓度22.58 mmoL/L，BMIM-PF6浓度5.24 mmoL/L，分析物分离度的预测值为2.53。结合实际操作考虑，将分离条件调整为pH 8.7，工作电压18 kV，缓冲溶液浓度23 mmoL/L，BMIMPF6浓度5.34 mmoL/L。制备混合对照品溶液3份，按该分析条件进行验证试验，以检验模型预测的准确度。结果芦丁与异槲皮苷的分离度为2.49（RSD=1.3 %），与预测值的偏差较小，说明得到的回归模型与实际情况拟合较好，优选的分离条件准确可靠，进一步验证了该模型的可行性。该分离度亦明显高于单变量优化所得值（R=0.93）。优化条件下，芦丁和异槲皮苷的毛细管电泳分离图见图3。

图3 RSM优化条件下混合对照品溶液毛细管电泳图

2.8 准确度实验

本研究中，所用样品为传统中药，且产地较多，由于各地自然环境等客观因素的存在，导致各地样品的成分及含量有一定差异，给内标物的选取工作带来了一定难度，因此本研究采用外标法进行定量。分别准确称取芦丁、异槲皮苷对照品各2.0 mg，用乙醇溶解至2 ml，得1 mg/ml芦丁、异槲皮苷混合对照品溶液。向已知含量的湖北产通经草样品中按0.1 mg/g加入混合对照品溶液，按2.1项条件进样分析，结果见表4。由表4可见，两种分析物的回收率在102.4 %～107.9 %之间，RSD（n=5）分别为4.3 %，4.7 %，表明该方法具有良好的准确度和可靠性。