一种全新结构PDE-5抑制剂的成药性研究

黄艳妮，房绍英，刘 纯，郑晓霞，何小华，张洪坤，程艳玲*

（1.山东省药学科学院 山东省化学药物重点实验室，山东 济南 250101；2.山东商业职业技术学院，山东 济南 250101）

勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）是指在过去的3个月中，阴茎持续不能达到或维持足够的勃起以进行满意的性交[1]，是男科常见的一种疾病。有研究表明，全球约有1.5亿的男性患有不同程度的ED，其中40岁以上男性发病率约为40 %，且随着年龄的增加ED发病率逐年升高，在超过70岁的男性中，ED的发生率为75 %[2]。ED的发生不仅与年龄有关，还与心理因素、手术创伤、生活习惯及心血管疾病等直接相关[3]。ED的产生会严重影响患者及伴侣的身体及心理健康，给家庭和社会带来沉重负担。

目前治疗ED的药物包括以下几类：5型磷酸二酯酶抑制剂（PDE-5）、平滑肌松弛药物、α-肾上腺素能受体抑制剂、5-羟色胺受体抑制剂、激素类药物、中药等[4]。在这些药物中，PDE-5抑制剂是治疗ED的一线药物，可用于各种原因导致的ED，其安全性和有效性在临床上得到广泛认可，已上市的PDE-5抑制剂类药物包括西地那非、他达拉非、伐地那非、阿伐那非、优地那非和米罗那非等7个药物[5-6]。

PDE-5抑制剂临床应用过程中，仍存在一些有效性及安全性问题，有研究发现[7]，有约20 %的患者对PDE-5抑制剂无应答，且西地那非及伐地那非对PDE-6的选择性较差，临床使用过程中患者会出现视觉障碍的不良反应；他达拉非解决了对PDE-6的选择性问题，但对PDE-11有一定的抑制作用，临床使用过程中可能出现背痛症状，因此研发全新结构的新型PDE-5抑制剂用于治疗ED，具有重要的临床意义及社会意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器

数显游标卡尺（桂林广陆数字测控公司）；Scout SE型电子天平（奥豪斯公司）；Thermo Fisher Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；API4500三重四级杆质谱仪（ABSCIEX中国公司）；Eppendorf移液器（德国艾本德公司）；AUW-120D型电子分析天平（日本岛津公司）；MS3型漩涡混悬器（IKA公司）；Z216MK高速冷冻离心机（德国哈默股份公司）；Milli-Q Advantage A10超纯水仪[默克化学技术（上海）公司]；EZ Reader Ⅱ酶标仪（Caliper公司）。

1.2 材料与试剂

化合物1（山东康迈祺，批号：PU-170617，纯度：99.67 %）；枸橼酸西地那非（Maya-R提供，批号：MAYA-CR-1138，纯度：99.5 %）；羧甲基纤维素钠（上海沪试实验室器材公司，批号：F20110211）；PDE5A1（BPS，批号：60050）；PDE6C（BPS，批号：60062）；PDE11A4（BPS，批号：60110）；384孔板（Perkin Elmer，批号：6007279）；格列吡嗪（中国食品药品检定研究院，批号：100281-201203，含量：99.5 %）；甲醇[赛默飞世尔科技（中国）公司，色谱纯，批号：140400]；甲酸[赛默飞世尔科技（中国）公司，批号：163701]；乙腈[赛默飞世尔科技（中国）公司，色谱纯，批号：151296]；肝素钠注射液（山东鲁抗辰欣药业，批号：1609286421）。

1.3 实验动物

KM小鼠，80只，雄性，体重18.1～25.2 g。SD大鼠，27只，雄性，体重220～270 g，大、小鼠均由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，生产许可证号：SCXK（鲁）20140007。大、小鼠均饲养于万级屏障环境中，按GB/16886.2动物的福利要求规范进行管理，室温控制为20～25 ℃，相对湿度控制为40 %～70 %，昼夜明暗交替时间12 h/12 h。动物使用许可证号：SCXK（鲁）20140008。

新西兰兔，24只，雄性，体重为2.0～2.5 kg，由济南西岭角养殖繁育中心提供，生产许可证号：SCXK（鲁）20150001。普通环境中饲养，每笼1只，室温19～26 ℃，温差≤4 ℃，换气次数8～10次/h，昼夜明暗交替时间12 h/12 h。动物使用许可证号：SCXK（鲁）20140008。

2 方法

2.1 化合物1对PDE-5A1，PDE-6C及PDE-11A4的体外抑制作用

准确称取化合物1，加入DMSO充分溶解，配置成10 mmol/L母液保存。试验时稀释为所需浓度，最高浓度为10 μmol/L，然后依次4倍稀释。体外酶活性检测方法如下：在96孔板中加入20 μl底物[10 μmol/L荧光素标记的环-磷鸟苷（FL-cGMP） ]，化合物1溶液1 μl，1.38 ng/μl酶缓冲液[缓冲液由100 mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸（pH 7.5），5 mmol/L MgCl2和0.002 %月桂醇聚氧乙烯醚组成]29 μl。30 ℃孵育1 h，加入 70 μmol/L EDTA 20 μl终止反应，每孔转移反应液26 μl至384孔板，EZ Reader II酶标仪检测读数，计算抑制率，Prism 5.0软件计算半数抑制浓度（IC50）。抑制率＝（转化率ZEP-转化率样品）/（转化率ZEP-转化率HEP）×100 %，式中转化率ZEP为不加化合物1的空白对照组的荧光值，转化率样品为加化合物1样本的荧光值，转化率HEP为不加酶的空白对照的荧光值。

2.2 化合物1对正常家兔阴茎勃起功能的影响[8-9]

取雄性新西兰兔24只，适应1周后开始试验，试验时按体重随机分为4组，分别为西地那非组（剂量2.3 mg/kg）、化合物1高、中、低剂量（2.3，1.15，0.06 mg/kg）组，每组6只。开始试验前每天捉拿家兔，让家兔习惯反复的捉拿操作后开始给药刺激。各给药组灌胃给予相应的药物溶液5 ml/kg，灌胃给药前及给药后5，15，30，60，120，240，300 min分别用数显游标卡尺测兔阴茎长度，每次测量过程中避免卡尺触碰阴茎。根据各时间点阴茎长度及时间，绘制长度-时间曲线，并计算曲线下面积（AUC）。

2.3 化合物1 SD大鼠体内药动学研究

取雄性SD大鼠22只，适应1周后开始试验，试验时按体重随机分为4组，分别为化合物1静注组（剂量4.5 mg/kg）、化合物1口服高、中、低剂量（9，4.5，2.25 mg/kg）组，每组5～6只。禁食不禁水约12 h后，各组灌胃或静脉注射给予相应的药物溶液10 ml/kg。各组大鼠给药前眼眦采血，静注组于药后0.25，0.5，1，1.5，2，4，6，8，10，12，24 h 眼眦采血，口服组于药后0.5，1，2，4，6，7，8，10，12，14，24，30 h眼眦采血。采血约0.5 ml，置入肝素钠抗凝的离心管，4 ℃ 10 000 r/min离心5 min，制备血浆。血浆样品采用高效液相质谱-串联色谱（LC/MS/MS） 分析，梯度洗脱，MS检测离子对：化合物1（m/z470.9/371.1），格列吡嗪（内标，m/z446.2/321.0）。利用DAS3.2.6软件计算药动学参数，以AUC0-∞计算化合物1的生物利用度。

2.4 化合物1大鼠血浆蛋白结合率研究

2.4.1 样本采集方法 取雄性SD大鼠5只，适应1周后开始试验，大鼠禁食不禁水12 h后，尾静脉注射给予4.5 mg/kg化合物溶液。于药后0.25，0.5，1 h眼眦采血，采血约0.5 ml，置入肝素钠抗凝的离心管，4 ℃ 10 000 r/min 离心5 min，制备血浆。取血浆100 μl于超滤离心管中，8 ℃、13 000 r/min离心30 min，收集滤液，其余血浆用于测定总药物浓度。

2.4.2 吸附率测定 配制浓度为30，150，300 ng/ml的化合物的20 %乙腈溶液，取100 μl，置入超滤离心管，8 ℃、13 000 r/min离心30 min，收集滤液。测定超滤前（ρpre）及超滤后（ρpost）化合物1浓度，根据以下公式计算药物非特异性结合吸附率（NSB）。

NSB=（ρpre-ρpost）/ρpre×100 %。

2.4.3 血浆蛋白结合率计算 分别取20 μl未经超滤血浆、超滤后血浆样本置入1.5 ml离心管，加入内标乙腈溶液（格列吡嗪浓度200 ng/ml）180 μl，涡旋2 min，12 000 r/min（15 ℃）离心5 min，取上清，进样2 μl检测。根据公式F=(A-B)/A计算大鼠体内血浆蛋白结合率，其中A为总药物浓度，B为游离药物浓度。

2.5 化合物1小鼠急性毒性初步研究[10]

取雄性KM小鼠80只，适应3 d后开始试验，试验时按体重随机分为8组，分别为西地那非不同剂量（758.4，568.8，426.7，320 mg/kg）组、化合物1不同剂量（21.8，19.3，14.5，10.9 g/kg）组，每组10只，禁食不禁水12 h后，各组小鼠灌胃给药1次，给药体积为40 ml/kg，给药后观察4 h，之后每天上、下午观察并记录小鼠的一般活动、行为、体重及死亡情况，共观察14 d，计算半数致死量（LD50）。

2.6 统计分析

3 结果

3.1 化合物1对PDE-5A1，PDE-6C及PDE-11A4的体外抑制作用

化合物1对PDE-5A1的IC50为0.17 nmol/L，而西地那非对PDE-5A1的IC50为5.38 nmol/L，提示化合物1对PDE5A1的抑制活性优于西地那非。化合物1对PDE-6和PDE-11的抑制活性与西地那非相近。见表1。

表1 化合物1对PDE-5A1、PDE-6C及PDE-11A4的IC50值/nmol·L-1

3.2 化合物1对正常家兔阴茎勃起功能的作用

化合物1对正常家兔阴茎勃起功能的作用见图1。由图1可见，化合物1剂量为0.6 mg/kg时对家兔阴茎勃起没有促进作用，剂量为1.15，2.3 mg/kg时可明显促进家兔阴茎勃起。此外，化合物1在给药后15 min起效，在该模型中的最低起效剂量为1.15 mg/kg，维持时间为2 h左右，与西地那非相近。经计算，化合物1与西地那非在剂量为2.3 mg/kg时AUC分别为379.8，183.8 mm·min，两者差异无统计学意义（P＞0.05），进一步的比较需放大样本进行。

图1 化合物1在不同剂量下对正常家兔阴茎勃起功能的作用

3.3 化合物1 SD大鼠体内药动学研究

化合物1 SD大鼠中体内药动学参数见表2，血药浓度-时间曲线（C-T曲线）见图2、图3。由表2可见，化合物1口服给药剂量为2.25～9 mg/kg时Cmax、AUC0-t、AUC0-∞随剂量增加呈线性递增趋势，说明化合物1在SD大鼠中呈线性药动学特征。

相同剂量下，相比于静注给药组，化合物1口服给药组暴露量低（Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均低于静注组，P＜0.05）。同时，口服组表观分布容积（Vd）和清除率（CL）均高于静注组（P＜0.05），说明口服途径化合物1分布广，清除速率高。经计算，化合物1的生物利用度（F）值为13.63 %。

表2 化合物1在SD大鼠中的药动学参数

图2 SD大鼠分别灌胃给予低、中、高剂量化合物1后，平均血药浓度-时间曲线（n=6，5，5）

图3 SD大鼠静脉给予化合物1后，平均血药浓度-时间曲线（n=6）

3.4 化合物1大鼠血浆蛋白结合率研究

根据超滤膜非特异性结合（NSB）公式：NSB/%=（ρpre-ρpost）/ρpre×100 % 计算得药物吸附率为-9.41 %～2.99 %，表明超滤膜对药物不存在非特异性结合，可采用超滤法测定血浆蛋白结合率。经过进一步测试，化合物1的血浆蛋白结合率为99.97 %，见表3。

表3 化合物1血浆蛋白结合率

3.5 化合物1小鼠急性毒性初步研究

化合物1小鼠急性毒性初步研究结果表明：化合物1与西地那非出现的毒性反应相似，表现为消瘦、活动减少、体重增长缓慢等症状；死亡时间集中于给药后第6～9天，死亡动物主要脏器（脑、心、肝、脾、肺、肾）未见其他明显异常。化合物1灌胃给药的 LD50为14.8 g/kg，西地那非的LD50为580.6mg/kg。

4 讨论

ED是成年男子常见的一种疾病，随着我国老龄化的加剧，ED的发生呈明显的上升趋势。在40～70岁的男性中，ED的发生率高达50 %以上，虽然患病率居高，但去正规医院诊治的患者低于10 %[11]。正常的阴茎勃起是血管、神经、激素、海绵体多种因素共同参与，其中任何一个环节出现问题均可导致ED的发生。

在阴茎勃起的生理过程中，NO发挥着重要作用，当阴茎海绵体中的NO浓度增加时，直接激活鸟苷酸环化酶，从而促使第二信使环磷酸鸟苷（cGMP）的浓度增加，继而引起细胞内Ca2+浓度下降，平滑肌舒张，阴茎海绵体膨胀，体积增大，从而导致海绵体的白膜拉伸延长，白膜下静脉压迫变窄，静脉回流受阻，阴茎勃起，而当cGMP被PDE5降解时，cGMP浓度降低，从而不能引起阴茎勃起[12-13]。因此特异性阻断PDE5的药物可提高阴经海绵体内cGMP的浓度，用于治疗勃起功能障碍。

PDE家族有PDE-1～PDE-11 11个成员，在人体脑、心、肺、血管等部位分布广泛。PDE具有不同的底物专一性，其中，PDE-5，6，9特异性地选择作用于cGMP，PDE4，7，8选择性作用于环磷酸腺苷（cAMP），其他的PDE则对cAMP和cGMP均起作用[14]。参考已上市的PDE-5抑制剂药物文献[15]，在药物筛选阶段，我们重点考察药物对3个酶的抑制性，即PDE-5，PDE-6和PDE-11。其中PDE-5与药物的作用机制直接相关，而对PDE-6，PDE-11的抑制可能与药物的不良反应有关，PDE-6可能与视物模糊有关，PDE-11则可能与背痛和肌肉酸痛有关。在上市的PDE-5抑制剂类药物中，西地那非、伐地那非、优地那非、米罗那非和罗地那非对PDE-6的选择性较差；他达拉非对PDE-6的选择性较好，但其对PDE-11的选择性较差，但半衰期较长；而新一代的阿伐那非对PDE-6，11的选择性均好，但半衰期较短。

化合物1是山东康迈祺公司自主研发的1.1类创新药。化合物1对PDE-5A1的体外抑制作用优于西地那非，IC50为西地那非的1/31；化合物1在1.15～2.3 mg/kg剂量下可剂量依赖性地促进正常家兔阴茎勃起，同时在2.3 mg/mg剂量下，即西地那非的临床等效剂量，化合物1促进家兔勃起的作用略强于西地那非；化合物1具有较好的药动学性质，清除率较低，半衰期较长，可达3.9～12.42 h；化合物1的大鼠血浆蛋白结合率为99.97 %，属于高血浆蛋白结合率药物；小鼠急性毒性试验中，化合物1毒性明显低于西地那非。总之，化合物1具有较好的体内、外活性，对PDE-6及PDE-11具有较好的选择性，安全性较高，具有良好的成药性，值得进一步研究。