牡蛎肽对肾阳虚大鼠下丘脑垂体甲状腺轴调节作用的研究

李 亚,王 通,王广飞,王运智,于雁飞,高永林,*

(1.烟台嘉惠海洋生物科技有限公司,山东烟台 264006; 2.烟台大学生命科学学院,山东烟台 264005)

牡蛎俗称海蛎子、生蚝,是世界上养殖规模最大的贝类,也是我国四大养殖贝类之一,在我国沿海地区有广泛的人工养殖[1]。牡蛎中营养物质丰富,包括高含量的优质蛋白质,氨基酸组成完善,富含维生素及各种微量元素,尤其是牛磺酸含量较高[2]。牡蛎药食同源,不仅具有很高的食用价值,而且具有独特的保健功能[3]。牡蛎肽是以牡蛎为原料,利用分子生物技术酶解加工后经分离、纯化、干燥等步骤制成的分子量较低的低聚肽混合物[4]。牡蛎肽近年来研究广泛,牡蛎肽对机体有着抗氧化、抗高血压、降血糖、提高免疫力、抗肿瘤、改善学习记忆等重要作用[5-7]。

肾阳虚是一种中医名词术语。肾阳虚证是中医的基本证型之一[8],由于“肾阳虚衰,温煦失职,气化失权”所表现出的虚寒型证候,称为肾阳虚证。机体肾阳虚证的形成与神经系统、内分泌系统、免疫系统等多个系统紧密相关,是多系统和多器官功能的综合表现[9]。肾阳虚证在下丘脑-垂体-靶腺(肾上腺皮质、甲状腺、性腺、胸腺)轴均有不同环节、不同程度的功能紊乱,且主要的发病环节在下丘脑(或更高级中枢)的调节功能紊乱[10]。肾阳虚的主要病机为甲减[11-12],甲状腺功能低下在肾阳虚病机学上占有重要的地位[13]。肾阳虚的形成有先天遗传的因素,也受后天膳食营养、环境因素、生理状态、精神状态、日常生活习惯以及某些疾病和治疗的影响[14]。

动物机体在某些化学试剂的诱导下会出现内源性代谢紊乱和失调,导致机体出现病理和生理上的改变[15]。本实验通过对大鼠肌肉注射氢化可的松建立大鼠肾阳虚模型,以大鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴中各激素水平的变化来判断肾阳虚模型的建立,并在建立模型过程中对动物给予不同剂量牡蛎肽灌胃处理,通过测定血清中游离三碘甲状腺原氨酸(T3)、游离Ⅲ磺甲状腺原氨酸(T4)、促甲状腺素(TSH)等激素水平及甲状腺组织的病理变化,观察牡蛎肽对肾阳虚大鼠的作用是否与改善下丘脑-垂体-甲状腺轴的功能低下有关。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

健康SD大鼠 雄性,SPF级,9周龄,体重210～230 g,60只,由山东绿叶制药有限公司实验动物中心提供(动物许可号:鲁20140002);饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供;牡蛎肽 烟台嘉惠海洋生物科技有限公司(批号ML20180300205,肽含量为62.1%,平均分子量为480.37);氢化可的松注射液 天津金耀药业有限公司;T3、T4、TSH酶联免疫检测试剂盒 上海超研生物科技有限公司;Trizol试剂 北京索莱宝科技有限公司;逆转录试剂盒 Thermo公司;其余所用试剂 均为分析纯。

Multiskan MK3酶标仪 Thermo公司;CX31生物显微镜 日本奥林巴斯公司;TDL-40B台式离心机 上海安亭科学仪器厂;石蜡切片机 德国Leica公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计 将60只SD雄性大鼠适应性喂养后随机分为5组,即正常组、模型组、牡蛎肽300 mg/kg组、牡蛎肽150 mg/kg组、牡蛎肽75 mg/kg组。其中正常组不注射氢化可的松、不进行牡蛎肽灌胃、给予与牡蛎肽等体积的水;模型组以每天25 mg/kg剂量肌肉注射氢化可的松建立肾阳虚模型(成功建模的模型组动物表现为竖毛、采食饮水减少、活动减少、体重减轻,血清T3、T4含量降低、TSH水平升高);牡蛎肽组动物每天25 mg/kg剂量肌肉注射氢化可的松并灌胃给予相应剂量牡蛎肽(300、150、75 mg/kg)至实验结束,实验持续35 d。实验期间各组大鼠正常进食、正常进水。

1.2.2 样本采集 连续灌胃完毕,对各组大鼠进行麻醉,抽取腹主动脉血,以1200×g(4 ℃)转速离心10 min,吸取上层血清分装,-80 ℃冰箱保存。打开颅骨后分离出下丘脑组织和甲状腺组织,甲状腺用福尔马林溶液固定保存,下丘脑使用液氮速冻。

1.2.3 血清T3、T4、TSH的检测 采用ELISA法,严格按照试剂盒说明书进行操作,测定各组血清样品中T3、T4、TSH的含量。

1.2.4 下丘脑促甲状腺激素释放激素(TRH)mRNA表达的检测 采用Trizol法提取下丘脑总RNA[16],严格按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录及扩增,实验中TRH上游引物序列为5′-GCTGGCTCTGG CTTTGAT-3′,下游引物序列为5′-GCCGGACCT GAACATTCT-3′[17],测定出各组结果后,以正常组的TRH mRNA表达水平为100%参照,计算并得出其余各组的TRH mRNA相对表达水平。

1.2.5 甲状腺病理学组织检查 将甲状腺组织常规切片,HE染色,显微镜下观察。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 大鼠血清 T3、T4、TSH水平

甲状腺是调节机体生命活动的重要内分泌腺体,甲状腺能够分泌甲状腺激素(T3、T4)来促进机体的物质代谢和能量代谢。甲状腺功能受上游下丘脑和垂体的调节,下丘脑释放TRH并作用于垂体促进分泌促甲状腺素(TSH),TSH进一步作用于甲状腺促进甲状腺激素的释放,同时机体血液中甲状腺激素浓度的升高可以通过负反馈调节抑制下丘脑TRH和垂体TSH的分泌,构成下丘脑-垂体-甲状腺轴的自发性控制回路[18-19]。当出现肾阳虚时,下丘脑-垂体-甲状腺轴功能受到影响从而导致相关激素的含量发生变化。本实验研究发现,肾阳虚模型组大鼠血清T3、T4水平均较正常组极显著降低(p<0.01),血清TSH水平有极显著升高(p<0.01)。研究结果与翟旭峰等[12]的报道一致。与肾阳虚模型组相比,牡蛎肽(300和150 mg/kg)在不同程度上提升了大鼠血清T3、T4水平、降低血清TSH水平(p<0.05)。各激素水平变化幅度与牡蛎肽灌胃剂量呈正相关(见图1、图2和图3)。研究结果表明,牡蛎肽(300和150 mg/kg)明显改善肾阳虚模型大鼠血清激素水平。

图1 牡蛎肽对大鼠血清T3的影响Fig.1 Effect of oyster peptide on serum T3 level注:与正常组相比,**表示差异极显著p<0.01; 与模型组相比,Δ表示差异显著p<0.05, ΔΔ表示差异极显著p<0.01;图2～图4同。

图2 牡蛎肽对大鼠血清T4的影响Fig.2 Effect of oyster peptide on serum T4 level

图3 牡蛎肽对大鼠血清TSH的影响Fig.3 Effect of oyster peptide on serum TSH level

2.2 大鼠下丘脑TRH mRNA表达

下丘脑所分泌的TRH是下丘脑合成及分泌的一种下丘脑激素,它可以促进垂体TSH的合成与分泌。同时,TRH的合成也受血液中甲状腺激素的调节。TRH在丘脑-垂体-甲状腺轴介导的肾阳虚病理过程中发挥重要作用,发生肾阳虚时下丘脑TRH水平降低。本实验研究结果发现,与正常组相比,肾阳虚模型组大鼠下丘脑TRH mRNA表达极显著降低(p<0.01)。与闵友江等[17]的研究结果一致，与肾阳虚模型组相比,牡蛎肽组(300和150 mg/kg)大鼠下丘脑TRH mRNA表达水平有显著性增加(p<0.05),且表现出一定的剂量依赖关系(见图4)。研究结果表明,牡蛎肽(300和150 mg/kg)对肾阳虚模型大鼠下丘脑TRH mRNA表达有明显改善作用。

图4 牡蛎肽对大鼠下丘脑TRH mRNA表达的影响Fig.4 Effect of oyster peptide on hypothalamus TRH mRNA express

2.3 大鼠甲状腺病理变化

由图5可见,正常组动物甲状腺病理组显示,实质内为大量甲状腺滤泡,滤泡壁由单层上皮围成,形成双层壁,少量的间质(图5A)。肾阳虚模型组动物甲状腺组织中甲状腺数量减少,且滤泡变得不清晰,充满胶质,且数量也有所减少,滤泡大小不等,大量的炎性细胞浸润(图5B)。与模型组比较,牡蛎肽(300 mg/kg)组动物甲状腺细胞数量有所增加,滤泡结构正常,界限较为整齐,与正常组较为接近(图5C)。牡蛎肽其他组动物甲状腺病变与模型组比较未见明显改善。研究结果说明300 mg/kg剂量的牡蛎肽对改善甲状腺的病变有明显保护作用。

图5 各组动物甲状腺组织形态学观察Fig.5 Histological observation of thyroid tissue

3 结论

肾阳虚证的主要发病环节为下丘脑功能紊乱,下丘脑-垂体-甲状腺轴异常引起的一系类表现和肾阳虚证类似,因此甲状腺轴的各激素水平可以间接反映肾阳虚证的状态。本次实验中,通过肌肉注射氢化可的松建立肾阳虚模型,并观察牡蛎肽的干预作用。由牡蛎肽各组的激素水平变化和可以看出,牡蛎肽可显著改善肾阳虚大鼠异常的T3、T4及TSH含量,并促进下丘脑TRH mRNA的表达,对甲状腺组织也有较好的保护作用,且本次实验中以300 mg/kg的剂量效果最好。本次实验说明牡蛎肽可改善肾阳虚模型大鼠的血清激素水平及下丘脑TRH mRNA的表达,可预防甲状腺病理变化,对改善肾阳虚证有明显的效果;其效果与调节下丘脑-垂体-甲状腺轴的内分泌功能有关,且在基因表达的水平上参与了调节。