部分地区荞麦食品中黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的污染评价

王 艳,胡 涛,朱丽伟,杨丽娟,黄小燕,陈庆富

(贵州师范大学荞麦产业技术研究中心,贵州贵阳 550001)

国内外黄曲霉毒素的研究主要集中在花生、玉米等粮油产品、奶制品和饲料等领域[5-7],研究的主要内容包括黄曲霉毒素污染情况调查,致病机理、限量标准、检测方法和技术改进、风险评估及防控措施等方面[8-10]。荞麦属于小宗粮食作物,相关研究较少,研究不同地区的荞麦食品黄曲霉毒素污染情况对制定黄曲霉毒素AFT限定标准具有重要的意义。目前中国、美国和日本等国家都制定了食品黄曲霉毒素限量标准和法规。美国对一般食品里面黄曲霉毒素食品中黄曲霉毒素(AFB1+AFB2+AFG1+AFG2)的最大残留限量为15 μg/kg,日本要求更为严格进口食品不得检出黄曲霉毒素,中国目前只对黄曲霉毒素AFB1制定了限量标准,AFB1在荞麦以及制品中最大限量为5 μg/kg,并没有黄曲霉毒素AFT总量的限制要求。

荞麦及其食品也存在黄曲霉毒素污染风险,针对荞麦在黄曲霉毒素研究较少和黄曲霉毒素AFT限量标准没有制定的情况,非常有必要展开荞麦黄曲霉毒素污染的调查,本文对我国6个地区6个类型荞麦食品4种黄曲霉毒素(AFB1、AFG1、AFB2、AFG2)进行调查分析其污染状况,为了解荞麦食品受黄曲霉毒素污染状况提供基础资料,为黄曲霉毒素总量(AFB1+AFG1+AFB2+AFG2)限量标准提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荞麦食品 2016年11月份从超市、荞麦技术产业研究中心和威宁的公司采集了63份荞麦食品,涉及到6个地区6个加工类型的荞麦食品选取,每份样品的采样量不少于500 g,散装样品每份采500 g,样品的详细信息见表1;黄曲霉毒素AFB1、AFG1、AFB2、AFG2标准品(纯度≥98,CAS号分别是1162-65-8,7220-81-7,1165-39-5,7241-98-7) 北京百灵威公司;甲醇、乙腈 均为色谱纯,德国Merck公司;正己烷 色谱纯,美国Tedia公司;三氟乙酸 分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

表1 样品信息Table 1 Sample information

续表

L-2000高效液相色谱仪(带荧光检测器) 日本日立公司;Afla StarTMR黄曲霉毒素免疫亲和柱 Romer Labs公司; KS-5200DE液晶超声清洗器 昆山洁力美超声仪器有限公司;TG-16G高速冷冻离心机 常州万丰仪器制造有限公司;WH-861涡旋混合器 太仓华利达实验设备有限公司;Exceed-Ca纯水超纯水组合系统 成都艾柯唐氏康宁科技发展有限公司;DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅 天津泰斯特仪器有限公司;N-EVAPTM112氮吹仪 美国Organomation Associates公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品衍生预处理 称取5 g粉碎的试样(粒径小于2 mm)于50 mL离心管中,加入20 mL乙腈-甲醇(50∶50,体积比)提取,置于超声振荡 20 min,在6000 r/min下离心10 min,移取约8 mL提取液经过功能净化管净化后,从收集池内准确移取2 mL净化液于棕色具塞小瓶中,50 ℃水浴下氮气吹干,加入200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸,涡旋30 s混匀后,(40±1) ℃恒温箱衍生15 min。氮气吹干,以初始流动相乙腈-水溶液(50∶50,体积比)定容至 1.0 mL,涡旋 30 s溶解残留物,过0.22 μm 滤膜,待测。

1.2.2 黄曲霉毒素的测定 参考GB 5009. 22-2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中提供的柱前衍生高效液相色谱法进行测定[11],待测样品由农业部农产加工品质量监督检验测试中心(北京)检测,并出具结果,检测的项目包括黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2,四个检测项目的检出限均为0.03 μg/kg。

1.2.3 检测色谱条件 色谱柱:Waters Symmetry C18(4.6 mm×150 mm,5.0 μm);柱温:40 ℃;激发波长:360 nm；发射波长:440 nm;进样体积:50 μL。

1.2.4 标准曲线绘制 通过高效液相色谱仪(带荧光检测器)进行测定,分别取1 mL黄曲霉毒素混合标准质量浓度分别为1.0、2.0、5.0、10、20 μg/g,按照1.2.1方法衍生,色谱条件同1.2.3,进行色谱测定,计算不同浓度下的峰面积。以峰面积(Y)对标准品的质量浓度(X)进行线线性回归,结果见表2。

表2 黄曲霉毒素标准曲线回归方程、相关系数Table 2 Regression equation and correlation coefficient of aflatoxin standard curve

1.3 统计处理

采用SPSS 17. 0 软件进行方差统计分析,p<0.05为差异有统计学意义。检测结果以大于方法的检出限为阳性(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2检出限均为0.03 μg/kg),超标判断标准是以美国食品药品监督管理局对黄曲霉毒素在食品中的残留限量规定为依据。样品中检出4种黄曲霉中的任意一种,即判定该样品AFs阳性,样品中检出毒素浓度之和即为该样品AFs含量。

2 结果与分析

2.1 荞麦食品黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2及AFs的调查结果

由表3可知,对63份样品进行AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的含量检测,结果显示,有22份样品检出黄曲霉毒素,主要以AFB1和AFG1为主,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2四种黄曲霉毒素的阳性率分别是:14.29%、9.52%、17.46%、1.59%。AFs阳性率为34.92%,AFs阳性样品的平均浓度为5.48 μg/kg,AFs浓度范围为0.16～26.80 μg/kg。本文和高秀芬等[12]对花生的黄曲霉毒素污染调查比较,从6个省份采集197份花生,阳性率58.38%,AFs阳性样品的平均浓度为91.74 μg/kg,浓度范围为0.20～2496.28 μg/kg,和花生比较荞麦阳性率低于花生阳性率,平均浓度远低于花生平均浓度,花生的浓度范围更广,远超荞麦的浓度范围,不同的是高秀芬的调查中花生的黄曲霉毒素主要是AFB1。四种黄曲霉毒素阳性率AFB1>AFB2>AFG1>AFG2。荞麦中主要是AFB1和AFG1,四种黄曲霉毒素阳性率AFG1>AFB1>AFB2>AFG2。根据美国食品药品监督管理局对黄曲霉毒素在食品中的残留限量规定为15 μg/kg[13],有两份样品超过15 μg/kg,超标率为3.17%,分别是邛都黑荞麦面条(24.6 μg/kg)、御酥坊金装荞酥(26.8 μg/kg)。按照食品中真菌毒素限量规定,小麦、大麦以及荞麦食品AFB1限量为5 μg/kg[14],和美国食品药品监督管理局(FDA)规定AFB1标准是一致的,超标食品其中最高的是邛都黑荞麦面条(13.2 μg/kg)，其次是伊田面馆荞麦面(6.01 μg/kg)、中裕荞麦挂面(5.60 μg/kg),AFB1阳性率为14.29%,超标率为4.76%。

表3 黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2及AFs的调查结果Table 3 Investigation results of aflatoxin AFB1、AFB2、AFG1、AFG2and AFs

2.2 不同地区黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2及AFs污染情况

由表4可知,不同地区黄曲霉污染情况不一样,从阳性率看,黄曲霉毒素AFs阳性率华北地区、西北地区阳性率最高为50.00%,AFB1阳性率华北地区最高为50.00%,AFB2阳性率华北和西北地区最高为16.67%,AFG1阳性率沿海地区最高为25.00%,AFG2阳性率西南地区最高为2.44%,其中华中地区没有检出黄曲霉毒素。从均值上看,AFs均值华北地区最高为3.10 μg/kg,AFB1均值华北地区最高为2.08 μg/kg,AFB2、AFG1、AFG2的均值最高为西南地区,均值分别为0.19、1.46、0.09 μg/kg,从超标情况看,不同地区的浓度范围只有西南地区高于15 μg/kg,西南地区的浓度范围为0.159～26.8 μg/kg,其他地区的浓度范围都低于15 μg/kg,超标样品均为西南地区,总体看除了华中地区,其他地区荞麦食品都存在不同程度的黄曲霉毒素污染。

表4 不同地区黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2及AFs污染情况Table 4 Pollution of aflatoxin AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 and AFs in different areas

2.3 不同类型的荞麦食品黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2污染情况

由表5可知,不同类型荞麦食品黄曲霉毒素污染情况不一样,从阳性率看,黄曲霉毒素AFs、AFB1二者阳性率最高的都为荞麦面,阳性率均为53.85%,AFB2阳性率荞麦茶最高为45.45%,AFG1阳性率荞麦种子最高为40%,AFG2阳性率荞麦粉最高为10%,从均值上看,黄曲霉毒素AFs、AFB1二者均值最高的都为荞麦面,均值分别为1.91、2.76 μg/kg,AFB2均值荞麦茶最高为0.77 μg/kg,AFG1均值荞麦饭最高为3.83 μg/kg,AFG2均值最高是荞麦粉为0.38 μg/kg。从超标率看,不同加工类型的荞麦食品AFs浓度范围只有荞麦面和荞麦饭超过15 μg/kg,荞麦面的浓度范围1.60～24.60 μg/kg,荞麦饭的浓度范围为0～26.80 μg/kg,其他类型都低于15 μg/kg,根据美国食品药品监督管理局对黄曲霉毒素在食品中的残留限量规定为15 μg/kg,因此需要加强荞麦面和荞麦饭的监控和管理。

表5 不同加工类型的荞麦食品黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2及AFS污染情况Table 5 Pollution of aflatoxin AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 and AFS in buckwheat food of different processing types

2.4 不同地区以及不同加工类型荞麦食品和黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2方差分析结果

从表6可以看出,AFB1在类型上差异性显著(p<0.05),说明不同类型的荞麦食品对AFB1含量有极显著影响,黄曲霉毒素AFB2、AFG1、AFG2含量在类型上差异性不显著(p>0.05)。从表7可知,荞麦面的AFB1含量与其他类型AFB1含量有显著差异,说明荞麦面比其他类型的荞麦食品AFB1更容易超标。黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2在地区间差异性不显著(p>0.05)。不同地区所选的样品数量和类型不一致,部分地区的样品量和样品类型选择不足,由于西南地区是荞麦的主产区,并且样品数多,后期将展开西南地区不同类型对黄曲霉毒素的分析。

表6 类型以及地区间AFB1、AFB2、 AFG1、AFG2方差分析结果Table 6 Analysis results of variance of AFB1,AFB2, AFG1 and AFG2 in different types and regions

表7 各种类型AFB1含量均数的两两比较(S-N-K法,α=0.05)Table 7 Comparison of the AFB1 content averages between the various types(S-N-K method,α=0.05)

2.5 西南地区不同类型荞麦食品和黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2方差分析结果

从表8可以看出西南地区不同加工类型的荞麦食品和黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2差异性不显著,西南地区影响黄曲霉毒素超标的主要原因推测可能是其他因素引起的。

表8 类型和AFB1、AFB2、AFG1、AFG2方差分析结果Table 8 Analysis results of variance of AFB1， AFB2,AFG1 and AFG2 in different types

2.6 收成月平均温度、收成月平均降水量对四种黄曲霉毒素的影响

从表9可以看出,收成月平均温度与AFB1呈极显著正相关(r=0.41,p<0.01),说明收成月平均温度越高,AFB1含量越高,收成月平均温度与AFB2、AFG1、AFG2没有显著相关性(p>0.05)。收成月平均降水量与AFB1、AFB2、AFG1、AFG2差异性不显著(p>0.05)。随着AFB1含量的增加,AFG1的含量也增加,二者之间呈显著正相关(r=0.30,p<0.05)。

表9 收成月平均温度,收成月平均降水量、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2间的相关关系Table 9 Correlation among monthly average temperature and monthly average precipitation in harvesting season,AFB1,AFB2,AFG1 and AFG2

3 讨论与结论

我国于1972、1973、1974 及1981年先后在全国进行食品中 AFB1的普查工作,结果发现长江和长江以南地区黄曲霉毒素污染较北方各省污染较重[16],此次调查结果也显示地址位置西南地区黄曲霉毒素污染比其他地区严重,只有西南地区超过美国食品药品监督管理局黄曲霉毒素在食品中的残留限量规定,其他地区没有超过限量标准,王君等[17]从8个省份采集了花生及其花生样品,调查结果显示玉米中黄曲霉毒素的检出率为70.27%,最高为1098.36 μg/kg,并有14.86%的玉米样品中黄曲霉毒素AFB1含量超出国家及国际食品法典限量标准限量标准。黄湘东等[18]抽检了88份大米、花生及其制品中,黄曲霉毒素总阳性率达62.5%,总超标率14.8%,其中花生渣污染最严重,阳性率为100.0%,超标率高达80.0%。荞麦的阳性率34.92%,整体污染水平不高,仅有3.17%超过限量标准,但是荞麦食品污染也不容忽视。长期处于黄曲霉毒素暴露的情况肝癌的发病率风险增高[19],应该严格把关各类荞麦食品,对流通以及加工环节进行监督,从而降低食源性疾病发生的几率,保证居民身体健康。

此次调查结果显示,尽管荞麦食品整体处于较低的黄曲霉毒素污染状态,但是仍然有不合格现象,本文中黄曲霉毒素污染主要是AFB1和AFG1污染,分析地区和类型对黄曲霉毒素的影响,发现荞麦面AFB1更容易超标,分析收成月平均温度和平均降水量对黄曲霉毒素的影响,在一定范围的温度越高越容易产生AFB1,降低温度可以减少AFB1的产生。并且AFB1和AFG1之间相互也有影响,随着AFB1含量的增加,AFG1的含量也增加,以及AFB1和AFG1之间的相互的影响,均需进一步探索。黄曲霉毒素的污染及其程度受到各种因素的影响,包括粮食的地理位置、季节气候、种类和数量、粮食收割后的储藏条件等[20]。因为西南地区是主产区、样品数多,黄曲霉毒素AFS浓度范围大,黄曲霉毒素超标食品两份都在西南地区,推测可能是两份样品含水量较高,在贮藏或者加工过程中更容易产生黄曲霉毒素,玉米,花生中也得到证实含水量高的作物黄曲霉毒素更容易产生和增加[21-23],本研究显示加工产品的类型与黄曲霉超标有明显关系,这为荞麦黄霉素超标预防提供了方向。

我国食品中黄曲霉毒素限量标准与CAC、欧盟、日本、美国标准相比存在一定差异[24]。第一,新标准未涉及黄曲霉毒素(AFB1+AFB2+M1+M2)的总量标准,几种毒性叠加效应方面的要求相对缺失;第二,新标准增加了食品类别,但与欧盟标准相比覆盖面仍有缺失,尤其是缺乏针对不同用途的同类食品的区分。我国黄曲霉毒素研究花生和玉米的较多,对荞麦食品黄曲霉毒素的研究较少,研究荞麦食品的黄曲霉毒素的污染情况,为我国食品黄曲霉毒素限量标准提供了可参考的依据,建议增加食品中黄曲霉毒素总量的限值标准并将各种食品的限值进行细化。