牛至精油羧甲基纤维素活性包装膜制备及其抗氧化和抗菌性能研究

谭瑞心,张万刚,周光宏

(南京农业大学食品科技学院，肉品加工与质量控制教育部重点实验室, 江苏高校肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心,江苏南京 210095)

活性包装是一种新型的包装技术,在食品保藏和产品安全领域有着越来越重要的地位[1]。而活性包装目前大多通过向包装膜材料上喷洒、涂覆或添加功能性物质来实现其作用[2]。选择可生物降解的天然大分子物质为活性包装膜的基材,将天然的功能性成分加入到其中作为活性物质,制备具有指定功能的活性包装膜材料,它区别于传统的塑料高分子聚合物,无害无污染并且赋予包装新的活性功能,对食品的贮藏保鲜具有重要的意义[2]。

羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose,CMC)是一种从纤维素中分离出来的阴离子多糖[3]。它具有无毒、生物兼容、可生物降解并且具有良好的膜成型性能,被认为是一种潜在的可食用薄膜或涂层材料[4]。有研究表明在CMC中添加精油的涂层可提高保护效果并延长烤葵花籽和鱼肉的贮藏期[5-6]。在精油中,牛至精油(oregano essential oil,OEO)被认为是最有效的抗菌剂之一,它可以防止多种微生物的生长,包括细菌、酵母菌和真菌等[7]。牛至精油的抗菌和抗氧化活性可归因于其中含有大量的酚类化合物,主要是精油中的香芹酚和百里香酚发挥作用[8]。前期研究发现,在活性包装膜中添加牛至精油能够发挥出良好的性能[9-10]。但目前大多研究只针对抗氧化或抑菌单一活性功能进行探究,且将牛至精油应用到具有可降解功能性的羧甲基纤维素中的研究鲜有报道。本研究将牛至精油作为活性成分加入到羧甲基纤维素中作为活性物质,制备具有抗菌和抗氧化活性的包装膜,并探究牛至精油对膜物理、化学等性能的影响,为活性包装膜的实际生产和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羧甲基纤维素(柱层析)、牛至精油(98%) 上海源叶生物科技有限公司;甘油(AR)、吐温80 南京晶格化学科技有限公司;胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB) 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureu)和大肠杆菌(Escherichiacoli)菌种 南京农业大学肉品中心实验室保藏。

T-25数字匀浆机 德国IKA公司;CR-400便携式色差仪 日本Konica Minolta公司;千分测厚仪 浙江余姚正量工量具厂;磁力搅拌水浴锅 金坛市城西富威实验仪器厂;M2e酶标仪 美国分子仪器公司;HVE-50高压灭菌锅 日本Hirayama公司;S-3000N扫描电镜 日本Hitachi公司;傅里叶变换红外光谱 美国Thermo Nicolet Corporation公司;质构分析仪 英国Stable Micro System公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牛至精油-羧甲基纤维素活性包装膜的制备 参照Han[11]的方法并经预实验调整,称取CMC 1.0 g(1% w/v)加入蒸馏水中,80 ℃下磁力搅拌至完全溶解,向其中加入0.5 mL(0.5% v/v)的甘油作为增塑剂,继续磁力搅拌1 h后形成均匀、透明的膜液。然后将牛至精油和吐温80以10∶1的体积比进行混合后,按照0、1、2、3%(v/v)的精油含量,0、0.1、0.2、0.3%(v/v)的吐温80含量分别加入膜液中,在13500 r/min的速度下均质4 min得到成膜基液。在55 ℃下经过静置脱泡处理后将100 mL成膜液倒入直径为15 cm的培养皿中,在40 ℃的鼓风干燥箱中干燥20 h后揭膜分别贴上对照、OEO1、OEO2和OEO3的标签保存于密封袋中。

1.2.2 厚度测量 用精确度为0.001 mm的测厚仪精密测量薄膜厚度,随机测量每个膜样本中心及周边15处,取平均值。

1.2.3 颜色测量 使用色差仪测量膜的颜色,参照CIE LAB色度参数:L*为暗(0)到亮(100),a*代表红色(+)到绿色(-),b*为黄色(+)到蓝色(-)。测量前使用标准白板校正颜色,以白色标准板为背景在膜上随机选择15个点进行测量。总色差(ΔE)使用下面的公式计算:

式中:ΔL*、Δa*、Δb*指的是样品和作为背景的差值。

1.2.4 机械性能测量 机械性能的测定参照Mulla[12]等的方法进行调整,采用质构分析仪进行测定。按照要求组装仪器后,将膜样裁剪成2 cm×8 cm的矩形,使用ATG模式进行测定。测定的初始夹距为40 mm,拉伸速度为0.8 mm/s,拉伸距离为25 mm。利用公式计算得到断裂伸长率(E)和抗拉强度(TS)。计算公式如下:

式中:TS为拉伸强度,MPa;P为断裂时最大张力,N;S为样品面积,mm2。

式中:E为断裂伸长率,%;ΔL为断裂时的伸长量,mm;L为原长,mm。

1.2.5 DPPH自由基清除能力 膜的抗氧化能力参照Dashipour[13]的试验方法,并做适当的调整。称取25 mg膜样剪碎后置于5 mL蒸馏水中,充分搅拌使其溶解,从中取出0.1 mL加入3.9 mL的DPPH甲醇溶液(0.1 mmol/L)溶液中室温下避光孵育60 min。以纯甲醇作为空白对照,测定517 nm处样品的吸光度,并用以下公式进行计算得到自由基清除能力:

式中:A空为空白的吸光值,A样为样品的吸光度值。

1.2.6 红外光谱分析(FT-IR) 用傅里叶变换红外光谱仪对膜样进行分析,使用ATR模式记录膜在4000～500 cm-1的红外光谱,分辨率为4 cm-1,每个样本在室温下重复扫描20次[14]。

1.2.7 微观结构 利用扫描电子显微镜观察膜的水平表面和横断面形态,切取适当面积的膜样分别水平和竖直黏贴到相应的底座上。将制好的膜样在液氮下处理后截取横断面,分别将膜的水平表面和横断面固定到样品台上,喷金处理后在5 kV的加速电压下,分别在300和1000放大倍数下进行电镜观察。

1.2.8 抑菌活性 膜的抑菌性能参照Klangmuang[14]的方法,利用琼脂扩散法进行膜样抑菌性的测量。利用在固体琼脂上抑菌圈的大小来衡量膜样的抑菌性能,选择两种典型的食物腐败菌包含革兰氏阴性菌(大肠杆菌),革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)进行试验。将膜样裁剪成直径为6 mm的小圆片放在涂有100 μL菌液(108～109cfu/mL)的固体培养基上,将其放入37 ℃的培养箱中培养24 h后拿出,测量并记录抑菌圈的直径。

1.3 数据处理

所得数据用SAS 8.1进行方差分析,用Factorial ANOVA进行显著性分析,实验重复数为5。

2 结果与分析

2.1 羧甲基纤维素膜的颜色分析

应用于食品包装的活性包装膜,其颜色是衡量消费者接受程度的指标之一。从表1可以看出L*值随着精油添加量的提高呈现显著降低的趋势(p<0.05),膜样表面逐渐变暗,这是由于牛至精油中的酚类物质吸收了短波长的光而导致的[15]。含有牛至精油膜样的a*值均显著高于对照组,其中1%和2%组之间没有显著性差异,浓度3%膜样的a*值与低浓度相比显著增加(p<0.05)。ΔE和b*值随着精油添加量的提高呈现显著上升的趋势(p<0.05)。膜样表面变黄变红的主要原因是牛至精油本身的黄棕色使活性膜颜色加深[16],但a*值和b*值数值较小,在膜的表面呈现出一定的棕黄色。在Benavides[17]的研究中增加藻酸盐膜中牛至精油的含量也得到类似的结果。

表1 牛至精油对羧甲基纤维素膜颜色的影响Table 1 The effect of oregano essential oil on the color of carboxymethyl cellulose film

2.2 羧甲基纤维素膜的厚度和机械性能分析

通过预实验确定活性膜中各成分添加含量,将精油添加最高浓度设置为3%。当活性膜中含有高浓度的精油时,由于乳化液的不稳定性和脂质的分散能力而导致不规则的油脂分布,从而影响膜的性质形成不同厚度的膜样[18]。从表2我们可以看到膜样的厚度均小于0.2 mm,厚度随精油添加量增加而显著提高(p<0.05)。这与Herrera[19]的研究中添加油到膜中的结果相同,而Perdones[20]的研究中发现,高浓度精油含量的活性膜在干燥过程中会因为精油的损失而使膜的厚度降低。这可能是由于添加精油浓度过高导致的,而本实验中最高浓度为3%避免了此情况的发生。

表2 牛至精油对羧甲基纤维素膜厚度和机械强度的影响Table 2 The effect of oregano essential oil on the thickness and mechanical strength of carboxymethyl cellulose film

包装材料需具有抗断裂和耐磨损的能力,从而在产品处理、包装、运输和储藏过程中对产品起到保护作用。抗拉强度是指薄膜能够承受的最大拉伸能力,而断裂伸长率是测试样本在断裂前的最大长度变化[21]。从表2可以看出,对照组的断裂伸长率显著高于其他处理组,1%、2%和3%精油处理组间无显著差异(p>0.05)。加入精油的活性膜抗拉强度随添加量的增加而显著降低(p<0.05),这种变化与其他研究[15,22-23]将精油加入到多糖制成的膜中得到的结果一致。抗拉强度和断裂伸长率与膜的微观结构和分子之间的相互作用力有关[16]。油脂的扩散使油和聚合物的弱交互作用部分替代了聚合物之间的强交互作用,从而使膜的网络结构变差,降低膜的抗拉强度[24]。本实验样品主要以包覆食品的形式作为内包装,可以一定程度的接受抗拉强度的降低。

2.3 羧甲基纤维素膜的微观结构分析

从图1可以看出,对照组薄膜的表面结构与处理组相比更加均匀和光滑,其断面结构较为紧致、平整,体现出羧甲基纤维素良好的成膜性能。而添加牛至精油的薄膜则呈现出较为松散的结构,在膜的表面可以看到有圆球状的突起和凹陷,并且随着精油浓度的增加逐渐变大。OEO1膜样的表面可以看到有少量孔洞,随着精油的浓度增加膜样表面微孔变多,形状不规则且分散不均匀。精油正是从膜样表面的微孔释放出来从而实现其自身的特性。

图1 牛至精油对羧甲基纤维素膜微观结构的影响Fig.1 Effect of oregano essential oil on the microstructure of carboxymethyl cellulose film注:水平表面放大倍数为300,横截面放大倍数为1000。

从薄膜的横截面来看,对照组的断面更加整齐均匀,处理组的断面可以看到很多形状不一的微孔和颗粒状突起,这与扫描电镜的样品表面结果相符。这归因于精油浓度增加产生更大的团块和高频率的碰撞,絮凝率上升使矩阵结构更加不均匀[25-26]。均质形成的气泡和加入的脂滴与连续的多糖网状结构相结合[11],这也是精油能够从膜中释放出来实现其本身的活性功能的原因。在膜的干燥过程中,表面的收缩力也是造成乳化剂网络结构中不规则油滴形状的可能因素,同时油滴的蒸发也会在膜的表面形成微孔[13]。其他研究[27-28]将精油添加到多糖膜中也得到相似的结果。

2.4 羧甲基纤维素膜的红外光谱分析

从图2可以看出,在特征区中膜样在波数3700～3000 cm-1之间的吸收峰是由于官能团O-H中氢键的伸缩振动,主要来自于羧甲基纤维素。在波数3000～2800 cm-1之间有两个峰,分别为-CH3和-CH2中饱和C-H键的伸缩振动[29]。波数在1800～1550 cm-1之间的吸收峰为C=O的伸缩振动[14]。C-H键或N-H的变形振动在1500～1300 cm-1波长处出现,波长在1150～1000 cm-1吸收峰为C-O键的伸缩振动及O-H键的弯曲震动[30]。Moyano将柠檬精油加到藻酸钠膜中的研究也得到类似的结果[31]。对照组的膜样和添加牛至精油的膜呈现出相似的峰值,在1700～1000 cm-1之间加入精油后吸收峰变强,这说明加入的精油与羧甲基纤维素并没有发生化学变化,只是物理性的结合[32]。

图2 牛至精油对羧甲基纤维素膜红外光谱的影响Fig.2 The effect of oregano essential oil on carboxymethyl cellulose film in infrared spectrum

2.5 羧甲基纤维素膜的DPPH自由基清除能力分析

自由基清除能力是用来衡量膜抗氧化能力的主要指标,DPPH测定是衡量样品自由基清除能力非常简便有效的方法[33]。从图3的结果可以看到,添加精油的薄膜DPPH自由基清除能力在31.35%～45.58%之间,与对照组差异显著(p<0.05)。精油浓度为2%和3%活性膜的DPPH自由基清除能力均显著高于1%精油浓度(p<0.05)。但3%精油浓度的活性膜自由基清除能力与2%浓度相比并不显著(p>0.05),这可能由于高浓度的精油经过乳化均质后,在干燥过程中的挥发限制了活性膜抗氧化能力的提高的缘故。在膜中添加精油或植物提取物可以提高膜的抗氧化性质,这与前人的研究结果相一致[34-36]。牛至精油中的香芹酚、百里香酚和聚伞花素等主要成分是为其提供抗氧化活性的主要原因[37]。

图3 牛至精油对羧甲基纤维素膜DPPH自由基清除能力的影响Fig.3 Effect of oregano essential oil on DPPH scavenging capacity of carboxymethyl cellulose film注:小写字母不同表示差异显著(p<0.05)。

2.6 羧甲基纤维素膜的抑菌性分析

通过抑菌圈法测定膜的抗菌活性强弱,选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌这两种具有代表性的微生物进行检测[38]。由表3可以看出,对照组没有出现抑菌圈,这表明羧甲基纤维素无抑菌性。而添加牛至精油的活性膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈随着精油含量的增加显著提高(p<0.05),这主要是由于精油中的酚类物质发挥的作用[17]的缘故,这与Sanchezgonz将茶树精油添加到壳聚糖膜中的研究结果一致[39]。精油与羧甲基纤维素的结构相结合,可以使酚类物质释放从而抑制微生物的生长[35]。

表3 牛至精油对羧甲基纤维素膜抑菌能力的影响Table 3 The effect of oregano essential oil on the bacteriostatic ability of carboxymethyl cellulose film

3 结论

加入牛至精油能够显著改变膜的厚度、颜色和机械性能。扫描电镜发现,牛至精油使膜样表面和内部结构发生变化,微孔增多结构变的不均匀,而这也是精油从膜中释放出来发挥其活性的原因。从红外光谱的结果可以看到,牛至精油的加入没有与羧甲基纤维素发生化学反应。随着精油浓度的提高,酚类物质发挥作用使膜样的抗氧化性能有显著的上升,并显著提高了抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的能力。综合考虑膜的感官质量和成本,含有2%精油活性膜具备良好的物理性能的和较强的抗菌和抗氧化活性,可以有效地防止食品腐败变质,延长食品的货架期。