不同储存条件下的蜂王浆中红外光谱判别方法

陈繁，刘翠玲*，陈兰珍，孙晓荣，李熠，金玥

1(北京工商大学 计算机与信息工程学院，北京，100048) 2(北京工商大学,食品安全大数据技术北京市重点实验室，北京，100048) 3(中国农业科学院，蜜蜂研究所农业部蜂产品质量安全风险评估实验室，北京，100093)

蜂王浆是由工蜂舌腺和上颚腺分泌的一种乳浆状物质，其化学成分复杂，主要含有水分、蛋白质、氨基酸和大量活性蛋白酶等物质，属于纯天然营养保健食品，具有调节免疫、抗氧化、改善睡眠等极其重要的功能[1]。但蜂王浆中含有的一些活性成分稳定性较差，对贮存条件要求较高。蜂王浆品质变差主要体现在水溶性蛋白的降解[2-5]。张红城等[6]研究表明，随着蜂王浆在室温贮存时间的延长，其含有的水溶性蛋白85.2 kDa(葡萄糖氧化酶)和MRJP-4发生较大程度降解，因此，蛋白质的变化可作为鉴别蜂王浆品质的指标[6-8]。但目前对蜂王浆品质变化的检测主要是通过高效液相色谱法、SDS-PAGE凝胶电泳等方法进行，专业性强，技术难度大，且需要昂贵的仪器设备。探究一种快速、无损的方法来有效地鉴别不同储存条件下的蜂王浆具有重要意义。

近年来中红外光谱技术以快速、无损、高效等优点广泛应用于食品、农业等领域，且其不需要对样品进行过多的前处理操作就可以获得大量信息，指纹性强，对样品进行定性分析具有较好的效果[9-12]。吴黎明等[13]利用傅里叶变换红外光谱对蜂王浆的新鲜程度进行研究，分析比较了蜂王浆的红外谱图，及其相对峰强与贮存条件之间的相关性，研究表明，利用红外光谱评价不同的贮存条件下蜂王浆的新鲜度是可行的，但未结合化学计量学算法对蜂王浆红外光谱建立定性分析模型。徐荣等[14]对比了肉苁蓉样品及其活性成分提取物的红外光谱图差异，取得3种提取物的特征红外吸收峰，计算分析得出不同波段内药材图谱与提取物的红外相关系数呈极显著相关，研究表明中红外光谱可作为药材定性分析的快速有效方法。这些研究均表明中红外光谱在定性分析方面具有较好的应用前景，且更容易提取出有效信息，表达出丰富的样品信息，分子选择性更好，在蜂产品定性检测方面中具有较大的发展空间[15-19]。

本研究应用中红外光谱技术，以冷冻条件和室温下储存7、14、21 d的蜂王浆为样品，采用VERTEX 70傅里叶红外光谱仪扫取、分析不同储存条件下的蜂王浆中红外光谱图，并利用标准正态变换、savitzky-golay卷积求导法对光谱数据进行预处理，并结合支持向量机算法(support vector machine，SVM)和正交偏最小二乘判别(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)建立蜂王浆的定性分析模型。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品为中国农业科学院蜜蜂研究所提供的荆条浆，共34份。

VERTEX 70傅里叶红外光谱仪，德国Bruker公司；智能生化培养箱SPX-80，杭州硕联仪器有限公司。

1.2 试验方法

取冷冻状态下的蜂王浆样本34份，为避免不同样品间的差异，取同一批冷冻蜂王浆样品分装到离心管中，将分装出来的34份样品放置在25 ℃的生化培养箱，以模拟室温，同时避免了室内温度的不确定性。蜂王浆样品的培养方案：冷冻、室温条件下分别储存7、14、21 d。

为避免蜂王浆样品的进一步变化，操作应快速准确，试验温度保持在25 ℃左右。

1.3 光谱采集方法

试验采集不同储存条件的蜂王浆样品中红外光谱各34个。为了消除仪器漂移的影响，采集样品光谱数据前，首先采集空气光谱作为背景光谱，用样品光谱扣除相邻背景光谱后作为待分析的光谱数据。然后用吸管吸取少量蜂王浆样品均匀涂抹在样品室的衰减全反射ATR附件上，为避免样品间的交叉污染，每扫取完1个样品需要用酒精将样品室清洗干净。仪器参数设置为分辨率4 cm-1,样本扫描次数为16次，背景扫描次数16次，光谱范围4 500～600 cm-1。并利用OPUS 7.2软件进行光谱采集。

1.4 谱图分析

图1 不同储存条件的蜂王浆中红外光谱图

Fig.1 Mid-IR spectra of royal jelly under different storage conditions

图2 不同储存条件的蜂王浆中红外光谱图谱峰变化

Fig.2 Peak change of Mid-IR spectrum in royal jelly under different storage conditions

1.5 光谱图预处理

在光谱采集过程中，仪器采集的噪声及与自身信息无关的变量等一些干扰因素会影响模型的预测能力，因此为保证模型的稳定性，建模之前需要对原始光谱数据进行预处理，从而获得更多有效的样本信息[23]，并在此基础上对光谱图进行标准正态变换(standard normal variate correction，SNV)和Savitzky-Golay卷积求导(平滑点数为7)。图3为冷冻储存蜂王浆的原始中红外光谱图和预处理后的光谱图。

图3 光谱预处理前后对比图

Fig.3 Comparison chart before and after spectral pretreatment

2 结果与分析

2.1 支持向量机算法

如图2所示，不同储存条件的蜂王浆光谱图之间差异很小，很难用肉眼区分样本所属类别，需要利用定性方法建立定性模型，实现对蜂王浆的快速鉴别。本研究采用支持向量机(SVM)算法，建立蜂王浆不同储存条件的快速鉴别模型。SVM是一种有监督的模式识别算法，可解决小样本、高维度和非线性的问题。它的基本思想是通过核函数将线性不可分的输入数据映射到更高维的特征空间，求解线性约束问题后找到可以线性分割输入数据的最大间隔分类面。故采用SVM建立不同储存条件蜂王浆的定性分析模型[24-25]。

首先建立不同储存条件的二分类模型。采用基于网格搜索及交叉验证方法进行参数寻优的SVM多分类算法，以冷冻王浆与室温王浆(储存7 d)为样本，对预处理后的样本建立不同储存温度蜂王浆的二分类模型。其中随机选取建模集样本55个，预测集样本13个。建模结果如图4所示，其中箭头所指为误分类样本。可以看出仅有一个样本被误分类，模型预测准确率为92.31%。

图4 基于SVM的不同储存温度二分类模型

Fig.4 Two-class model of different storage temperatures based on SVM

为进一步探究中红外光谱在鉴别室温下储存不同时间蜂王浆的可行性，对室温下储存7、14、21 d的蜂王浆样本建立不同储存时间的三分类模型。共102个样本，随机选取82个样本作为建模集，20个样本作为测试集。建模结果如图5所示，随机选取的3类测试集样本全部分类正确，模型预测准确率为100%。为进一步验证同时探究最优判别方法，采用判别分析方法建立模型。

图5 基于SVM的室温储存不同时间三分类模型

Fig.5 Three-class model of different times of store at room temperature based on SVM

2.2 正交偏最小二乘判别分析

正交偏最小二乘判别分析是基于偏最小二乘判别分析(PLS-DA)法发展起来的算法，OPLS-DA法主要反映了自变量和因变量间的线性关系，并基于X变量建立Y变量的预测模型，根据X变量所得新的预测集数据构建预测变量Y。与PLS-DA不同的是，OPLS-DA将X变量中的系统变异分解为同Y线性相关的部分和同Y正交的部分，且正交变异组分的增加可以减少结果误差[26-28]。本试验采用交叉验证的方法对模型进行验证，即数据模型样本共N个，进行N次训练每次训练样本数为N-1个，由此获得模型预测指数，以实现模型的分类鉴别等目的。

以冷冻王浆与室温王浆(储存7 d)为样本建立不同储存温度的二分类模型。筛选出4个主成分，模型的自变量拟合指数(R2X)为0.859，说明4个主成分解释了85.9%的X变量；因变量拟合指数(R2Y)为0.88，说明4个主成分解释了88%的Y变量；模型预测指数(Q2)为0.775，说明模型预测能力为77.5%，内部交叉验证均方差(the root mean square error of cross-validation, RMSECV)值为0.23(表2)。一般R2和Q2>5时，认为模型的稳定性和预测能力较好，故可以认为试验所建模型是稳定且可靠的。不同储存温度OPLS-DA得分图如图6所示，可以看到冷冻储存样本与室温储存样本2类样本中仅有少数重叠，模型预测准确率为95.52%。

图6 不同储存温度OPLS-DA得分图

Fig.6 OPLS-DA score plot of different storage temperatures

室温储存7、14、21 d的蜂王浆共102个为样本，建立基于OPLS-DA室温储存不同时间蜂王浆的三分类模型，筛选出2个主成分时，R2X为0.701，R2Y为0.639，模型预测指数Q2最高为0.719，RMSECV为0.24(表2)。图7为室温不同储存时间OPLS-DA得分图，从图中可以看出，3类样本完全分离，建模效果较理想，可靠性高，模型预测准确率为96.97%。

图7 室温储存不同时间OPLS-DA得分图

Fig.7 OPLS-DA score plot of different times of store at room temperature

表2 模型参数与预测结果

Table 2 Model parameters and results

分类模型R2XR2YQ2RMSECV总体预测准确率/%二分类模型0.8590.880.7750.2395.52三分类模型0.7010.6390.7190.2496.97

3 结论

本试验采用中红外光谱技术结合SVM和OPLS-DA法对不同储存条件的蜂王浆样品进行了定性分析探究。通过对光谱图的分析发现，不同储存条件的蜂王浆样本在中红外光谱的1 480～1 800 cm-1和900～1 200 cm-1存在一定的位移，对光谱进行预处理后结合SVM和OPLS-DA法建立了不同储存条件蜂王浆的定性分析模型。其中基于SVM算法建立蜂王浆不同储存温度的定性模型预测正确率达到了92.31%，3类室温条件储存不同时间的蜂王浆定性分析模型预测正确率达到了100%。结合OPLS-DA法所建不同储存温度蜂王浆二分类模型和室温储存不同时间蜂王浆的三分类模型的预测准确率分别为95.52%和96.97%。结果表明，基于SVM和OPLS-DA法建立不同储存条件下的蜂王浆定性分析模型，模型效果较为理想，模型分类准确率高；同时表明采用中红外光谱技术作为一种快速、无损的方法对不同储存条件下的蜂王浆进行检测具有一定的可行性。