地诺单抗通过STAT3信号通路抑制骨巨细胞瘤的初步研究

刘起昆 鲍兴 李浩 蔡卓 李觅 杨彩虹

骨巨细胞瘤（giant cell tumor of bone,GCTB）是一种具有局部侵袭性的交界性肿瘤。在亚洲人群中发病率相对较高，约占骨肿瘤的20%［1］。目前骨巨细胞瘤的治疗以手术刮除或瘤段切除为主。非手术治疗策略如双磷酸盐类、放化疗、干扰素等，能够在一定程度上缓解病人的症状、控制肿瘤的进展，避免出现更严重的并发症，但存在复发率高甚至恶性病变的可能。因为肿瘤部位及治疗手段的不同，肿瘤的复发率差异较大，约为15%～50%［2，3］。

2013年美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准新药地诺单抗用于治疗成人或骨骼成熟的青少年中不能手术或手术可能导致严重功能障碍的骨巨细胞瘤，随后大量的临床随访和研究证明其良好的有效性及安全性。地诺单抗作为一种人源性的单克隆抗体，通过模仿机体内源性骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）的作用机制，特异性地结合RANKL使其溶解，阻止RANKL/RANK介导的破骨细胞的分化、成熟及活化，减少骨质破坏、抑制肿瘤的进展。目前认为骨巨细胞瘤中的多核巨细胞是一种反应性细胞，类似于炎性反应，我们通过Genecards在线数据库分析预测发现RANKL（TNFSF11）的启动子区中关联性最强的5个转录因子为STAT3、STAT1β、STAT1α、STAT1、FOXO4，其中信号转录因子STAT3与许多肿瘤的发生、发展密切相关，STAT3信号通路介导许多炎性反应过程。通过生物信息学分析（http://genemania.org）发现RANKL与STAT3信号通路关系密切（图1）。临床经验提示使用地诺单抗治疗后，骨巨细胞瘤病人骨质破坏被抑制，同时肿瘤基质细胞也大量消失，在此猜测STAT3及相关信号通路参与地诺单抗的抗骨巨细胞瘤作用。本研究拟通过免疫组化法检测地诺单抗治疗的骨巨细胞瘤组织与未经地诺单抗治疗的病变组织中RANKL、STAT3分子及下游相关分子指标的变化，同时利用TUNEL法检测经地诺单抗治疗后肿瘤细胞的凋亡情况并与未经治疗的肿瘤组织对比，明确STAT3及下游的相关分子是否参与骨巨细胞瘤的增殖和凋亡，并探究相关的分子作用机制。

图1 生物信息学分析结果图

材料与方法

一、一般资料

收集我院2013年1月至2018年12月手术治疗的31例骨巨细胞瘤病人，其中28例未经地诺单抗治疗（对照组），3例经地诺单抗治疗（研究组），男13例，女18例，年龄为21～78岁；股骨、胫骨部位23例，其他部位8例；共33个石蜡组织标本（对照组未经地诺单抗治疗的切片样本数30个；研究组经地诺单抗治疗的切片样本数3个），全部标本均经病理组织学证实为骨巨细胞瘤。

二、方法

苏木素-伊红染色（hematoxylin and eosin,HE）、Rankl、STAT3、Bcl-2、Cyclin D1羊抗兔单克隆抗体，即用型SABC检测试剂盒及TUNEL细胞凋亡检测试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。①肿瘤石蜡切片组织HE染色：按HE染色标准流程操作，石蜡切片烘箱烤片，常规脱蜡、梯度酒精水化，滴加苏木素染核，1%的盐酸酒精分化、PBS反蓝，滴加伊红染胞质，依次脱水、透明，中性树脂封片，显微镜下观察染色结果。②免疫组化检测：肿瘤组织标本用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，冷却，4℃保存制成蜡块，4 μm连续切片，采用SABC法进行免疫组织化学染色，严格按试剂盒说明书进行操作。所有切片常规脱蜡，PBS冲洗，3%的H2O2室温下孵育10 min，使内源性过氧化物酶失去活性，微波炉进行抗原修复，正常山羊血清封闭，滴加适当比例稀释的一抗，置于4℃冰箱过夜，然后滴加生物素化二抗及过氧化物酶标记的抗体，PBS清洗，DAB显色，苏木素对比染色。以PBS代替一抗作阴性对照。③TUNEL法检测石蜡切片病理组织中细胞的凋亡情况，严格按照试剂盒说明书操作，切片常规脱蜡，3%的H2O2室温下孵育10 min，灭活内源性过氧化物酶，滴加酶室温消化15 min，后加标记缓冲夜室温孵育2 h，滴加适当比例稀释生物素化抗地高辛一抗湿盒内室温反应30 min，然后滴加稀释的SABC室温反应30 min，PBS清洗，DAB显色，苏木素对比染色，中性树脂封片，镜下观察结果。

三、染色结果判断

Rankl、STAT3、Bcl-2和Cyclin D1阳性着色为棕黄色颗粒，位于细胞质、细胞膜或细胞核内。先在低倍镜下确定肿瘤组织内阳性表达部位，后用200/400倍镜观察蛋白分子表达的部位及阳性情况。肿瘤组织细胞凋亡检测细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。着色程度：不着色记0分，着浅棕色记1分，着棕色记2分，着深棕色记3分；着色细胞百分比（每个标本在高倍镜下取10个视野计算阳性着色细胞数占全部细胞数百分比）：25%以下记1分，25%～50%记2分，50%～75%记3分，75%以上记4分。上述两项参数相乘≥2分即认为有阳性表达。

结 果

一、石蜡切片HE染色结果

如图2所示，a为对照组骨巨细胞瘤病变组织，镜下主要由梭形肿瘤基质细胞和多核破骨样巨细胞组成，基质细胞散在分布于巨细胞周围；b为研究组病变组织，镜下见多核破骨样巨细胞几乎消失，残留部分细长单核基质细胞，大量的细网状纤维组织及编织骨形成，替代肿瘤组织。

二、免疫组化SABC法检测结果

对照组的肿瘤组织中RANKL、STAT3、Bcl-2和Cyclin D1的分子表达情况，如图3所示，RANKL主要表达于单核基质细胞；STAT3主要表达于多核破骨样巨细胞胞浆和肿瘤基质细胞胞膜；Bcl-2主要表达于多核破骨样巨细胞胞浆，散在表达于细胞核内；Cycin D1主要表达于多核破骨样巨细胞胞核。RANKL、STAT3、Bcl-2和Cyclin D1在对照组肿瘤组织中的阳性表达率分别为70%、53%、77%、73%（表1）。

图2 骨巨细胞瘤组织HE染色情况 a：未经地诺单抗治疗（×400）；b：地诺单抗治疗后（×200）

表1 对照组骨病变组织样本免疫组化结果［例（%）］

研究组的肿瘤组织中RANKL、STAT3、Bcl-2和Cyclin D1的分子表达情况，如图4所示，RANKL在残留的肿瘤基质细胞中散在表达，较未经治疗的肿瘤组织表达量明显下降；STAT3、Bcl-2、Cyclin D1未见表达。

三、TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡情况

图3 未经地诺单抗治疗的肿瘤组织中RANKL（a）、STAT3（b）、Bcl-2（c）和Cyclin D1（d）的分子表达情况（SABC法染色，×200）

图4 经地诺单抗治疗后肿瘤组织中RANKL（a）、STAT3（b）、Bcl-2（c）和Cyclin D1（d）分子表达情况（SABC法染色，×200）

如图5所示，对照组的肿瘤组织中多核破骨样巨细胞和梭形基质细胞核可见棕黄色颗粒，仅有少量肿瘤细胞存在凋亡；研究组病变组织中残留的肿瘤基质细胞可见明显凋亡。

四、地诺单抗临床治疗病例

病例1，女，27岁，因“左膝关节疼痛，活动受限2天”入院。第一次入院行活检术，病理证实为骨巨细胞瘤，病人出院规律地进行地诺单抗治疗半年后返院行病灶刮除+骨水泥填充治疗（图6）。

病例2，男，38岁，因“左股骨远端骨巨细胞瘤术后10个月复发”入院。在我院行病灶刮除+骨水泥填充+钢板内固定手术治疗，术后1周开始自行规律地进行地诺单抗治疗（图7）。

病例3，女，25岁，因“右小腿近端包块1年伴疼痛4月余”入院。活检证实为胫骨近端骨巨细胞瘤，病人出院自行规律进行地诺单抗药物治疗3个月后复查X线片发现病灶明显缩小、纤维钙化包壳形成，后再次入院行病灶刮除植骨治疗（图8）。

讨 论

图5 TUNEL法检测结果（×200） a：未经过地诺单抗治疗的肿瘤组织；b：地诺单抗治疗的肿瘤组织

图6 女，27岁，骨巨细胞瘤 a、b：地诺单抗治疗前X线片，可见股骨外髁病灶破坏骨质出现病理性骨折；c、d：地诺单抗治疗4个月后复查X线片，可见病灶较治疗前明显缩小，病灶边缘大量致密骨质形成；e、f：手术后第2天复查X线片，肿瘤病灶充分刮除，异体骨及骨泥填充残留空腔

正常人体内骨骼的维持取决于骨重塑过程中骨形成与骨吸收之间的动态平衡，而骨质的重塑主要由破骨细胞和成骨细胞参与，如果成骨与破骨之间失去平衡就会出现骨质溶解及骨质硬化等病变［4］，其中破骨细胞的分化和成熟在这一过程中起关键性作用。破骨细胞的形成主要通过RANKL-RANKOPG信号通路来完成，在细胞因子、生长因子、激素等活性分子辅助参与下M-CSF、RANKL与破骨前体细胞膜表面的受体结合，招募和诱导胞内的结合分子如TRAF6，从而调节下游的信号通路如Src-PI3KAkt信号通路、MAPKs信号通路、NFATc1信号通路等［5，6］，最终激活核转录因子AP-1和NFATc1，促进破骨前体细胞的分化和骨吸收相关的基因如TRACP、MMMP-9、组织蛋白酶K的表达［7-9］。

STAT3是STAT家族的一种蛋白，与肿瘤的发生、发展关系密切，属于致癌基因［10］。STAT3蛋白能活化参与细胞周期进展的基因如Fos、Myc、Cyclin D1，上调抗凋亡基因如Bcl-2和Bcl-XL的表达，对细胞的增殖、存活起重要作用［11，12］。在多种肿瘤组织中STAT3能够上调VEGF的表达，刺激肿瘤血管的生成。而VEGF可以通过经典和非经典的通路参与调节破骨细胞的形成［13］。此外，有研究发现JAK2/STAT3信号通路对RANKL诱导的破骨前体细胞的分化成熟具有关键影响［10］。Park等［14］的研究发现过氧化物酶Ⅱ能通过抑制STAT3信号通路负性调节脂多糖诱导的破骨细胞的形成。Xiong等［12］的研究表明茯苓多糖能够通过抑制NFATc1D的活性和ERK/STAT3的磷酸化来减弱RANKL诱导的破骨细胞的产生。这些研究结果说明STAT3及其相关的信号通路可能参与了RANKL介导的破骨细胞的形成过程。我们研究观察发现STAT3大量表达于多核巨细胞浆和肿瘤基质细胞胞膜，阳性表达率约为53%；地诺单抗治疗后的组织中未见有STAT3表达。

图7 男，38岁，左股骨远端骨巨细胞瘤术后复发 a、b：骨巨细胞瘤术后复发入院时X线片，可见股骨下段干骺端骨质破坏，肿瘤复发；c、d：行病灶刮除+骨水泥填充+钢板内固定术后4天复查X线片，肿瘤病灶充分刮除，骨水泥填充完全，内固定位置良好、牢固；e～h：术后地诺单抗治疗3个月（e、f）、6个月（g、h）复查X线片，可见病灶部位骨质愈合良好，大量新鲜致密骨质形成；i、j：术后10个月复查X线片，术后病灶恢复良好，未见肿瘤复发

图8 女，25岁，胫骨近端骨巨细胞瘤 a、b：地诺单抗治疗前X线片，可见胫骨上段骨质呈肥皂泡样溶骨性破坏；c、d：地诺单抗治疗2个月后，可见破坏灶明显缩小，周围形成致密骨质；e、f：地诺单抗治疗4个月后复查，显示病灶继续缩小、周围新生骨质及钙化灶继续形成扩大；g～n：术后3个月（g、h）、7个月（i、j）、13个月（k、l）及17个月（m、n）复查结果，可见骨质愈合良好，大量新鲜骨质及钙化灶形成，未见肿瘤复发迹象

Bcl-2蛋白是最早发现的细胞凋亡调节Bcl蛋白家族成员之一，在细胞凋亡的调控中起重要作用。Yamashita等［15］的研究发现Bcl-2（-/-）小鼠中破骨细胞减少、骨量增加，说明Bcl-2可能在破骨细胞的形成中扮演重要作用。同时有研究发现胰岛素能通过上调Cyclin D1和Bcl-2A1（抗凋亡蛋白）的表达促进破骨细胞的增殖［16］。这些研究说明Bcl-2蛋白家族对破骨细胞的形成具有重要影响，可能参与骨巨细胞瘤中破骨样巨细胞的形成并调节其功能。我们的研究发现Bcl-2主要表达于多核破骨样巨细胞胞浆、散在表达于胞核，阳性表达率约为77%，而经过地诺单抗治疗后未见明显的Bcl-2蛋白表达。

Cyclin D1是一种关键的细胞周期调节因子，主要功能是促进细胞增殖、驱动细胞周期由G1期进入到S期。有研究［17，18］发现Cyclin D1高表达于骨巨细胞瘤中的多核巨细胞核内，并推测是P21导致其在巨细胞核中的累积，甚至调节巨细胞的形成。Matsubayashi等［19］的研究表明Cyclin D1主要表达于骨巨细胞瘤的多核巨细胞胞核中，同时可能对巨细胞的形成而非细胞增殖产生重要作用。这些与本研究观察到的研究结果一致，Cyclin D1高表达于多核破骨样巨细胞胞核中，阳性表达率约为73%；地诺单抗治疗后病变组织破骨巨细胞消失，未见Cyclin D1分子的表达，这说明地诺单抗治疗能下调其表达。

地诺单抗作为一种人源性单克隆抗体，对RANKL有高度亲和力及特异性，通过阻断RANKL与RANK的结合，从而抑制破骨细胞的形成。本研究通过免疫组化检测发现RANKL主要表达于骨巨细胞瘤中的单核基质细胞内，而经地诺单抗治疗后病灶组织中多核破骨细胞消失、大量纤维骨组织形成，边缘区域残留部分梭形基质细胞，散在阳性表达RANKL分子，这与Yonezawa等［20］报道的病例研究结果吻合。同时观察到骨巨细胞瘤组织中STAT3及下游的Bcl-2、Cyclin D1分子表达量与RANKL的表达存在一定的联系，在RANKL表达量高的组织中，这三种信号分子表达量也相对较高，反之情况亦然。同时本研究利用TUNEL法检测地诺单抗治疗前后肿瘤细胞的凋亡情况，结果发现未经地诺单抗治疗的肿瘤组织中仅有少量肿瘤细胞凋亡，而治疗后多核破骨巨细胞完全消失、大量纤维编织骨形成替代病灶组织，残留的肿瘤基质细胞明显凋亡，说明地诺单抗治疗能够促进肿瘤细胞凋亡，但不能完全清除肿瘤基质细胞，地诺单抗可能通过抑制RANKL介导的STAT3信号通路，下调Bcl-2、Cyclin D1关键分子的表达，最终导致肿瘤细胞凋亡。

综上所述，我们推测STAT3信号通路可能参与了地诺单抗治疗骨巨细胞瘤的过程，地诺单抗可能通过抑制RANKL介导的STAT3的磷酸化，进而下调STAT3信号通路中抗凋亡蛋白Bcl-2和细胞周期调节蛋白Cyclin D1的表达，最终抑制破骨样巨细胞的形成、促进肿瘤基质细胞的凋亡（图9）。此外，需要指出的是本研究收集的研究组样本数量较少，结果不足以进行统计学分析，单纯的进行组间结果差异比较可能会存在一定的偏倚。后续如果有足够的病例标本及新鲜的样本组织，我们将进一步验证这一机制。

图9 地诺单抗通过抑制RANKL介导的STAT3信号通路抑制破骨细胞的形成机制