无角牦牛Hesx1基因多态性及其与生长性状的关联分析

张 浩，王宏博，马 武，贾聪俊，马晓明，吴晓云，褚 敏，阎 萍，成述儒，梁春年

(1.中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，甘肃 兰州 730050；2.甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州730070)

Hesx1(Homeobox expressed in ES cells)基因作为一种同源结构域转录因子，能够参与胚胎的早期发育，直接影响前脑和垂体的发育。垂体在调控垂体前叶分泌生长激素(Growth hormone，GH)、促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone，ACTH)、卵泡雌激素(Follicle stimulating hormone，FSH)、促黄体生成素(Luteotropic hormone，LH)等激素的过程中起到至关重要的作用，其中GH的分泌能够直接影响动物的生长性状，ACTH、FSH、LH的分泌也能够产生潜在影响，因此，Hesx1基因在动物的生长发育中具有重要的地位。Hesx1基因是由澳大利亚生物学家THOMAS通过探针筛选在小鼠的ES细胞中发现的，它含有氨基末端区域(Engrailed homology domain)和成对同源区域(Paired-like homeodomain)2个阻遏结构域，其中氨基末端区域能够衍生1个辅助阻遏物(Tlel)。在小鼠胚胎的早期发育过程中，Hesx1基因在前内脏内胚层(AVE)、前轴中胚层(AME)以及前神经外胚层(ANE)中均有表达；在小鼠胚胎发育中期9.5～12.5 d时，Tlel与Hesx1基因共同在小鼠颅颊囊(垂体前叶基础)中表达，但在12.5 d后表达量开始快速减少，而PROP1基因以及其他调控垂体前叶细胞的基因开始表达[1]。也有研究表明，在哺乳动物中首次发现了Hesx1基因的2个转录本序列编码一段相同的开放阅读框，同时在同源结构域内具有2个内含子[2]；非洲蟾Hesx1与xANF-1基因具有高度的同源性(80%)，说明Hesx1与xANF-1基因属于同一种同源结构域类型[3]。近年来研究还发现，Hesx1基因的突变会引起某些疾病的发生，如视觉发育不全(SOD)、联合垂体激素缺乏症(CPHD)等。SOD是由于突变的Hesx1基因C末端影响前脑发育，从而导致视神经和透明隔发育不完全，患病者主要表现为眼震、色盲、视觉异常、视敏度低、两眼间距过近、癫痫等[4-6]，此外，约70%以上的SOD病人的下丘脑以及垂体发育异常，会出现功能障碍并导致生长激素、甲状腺素刺激素、肾上腺皮质激素缺乏，最终表现为生长受阻或停滞[7-8]。CPHD是由于生长激素缺乏导致的多种垂体前叶激素缺乏的疾病，最常见病因之一是PROP1基因发生突变。正常状态下，Hesx1基因能够与PROP1基因结合形成二聚体，具有拮抗作用，因此，Hesx1基因对垂体前叶激素的分泌具有重要的调控作用[9-11]。综上所述，Hesx1基因通过对前脑与脑垂体的影响，对动物的生长发育起到至关重要的作用，目前，国际上很少有关于Hesx1基因在家畜上的研究报道，极大多数是对人类Hesx1基因突变所引起疾病的研究[12-14]，以及对小鼠等模型动物的相关研究报道[15]，而在牦牛上未见相关报道。本研究首次在无角牦牛上对Hesx1基因多态性及其与生长性状的关联进行分析，从而揭示Hesx1的基因效应，以期为牦牛的育种提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物及生长性状测定

选取青海大通牛场的6月龄断奶无角牦牛共计364头组建试验群体，根据耳号编写生长数据记录册，同时测定所有6月龄无角牦牛的生长性状(包括体质量、体高、体斜长、胸围)，静脉采集血液样本并根据耳号编号记录。将所有供试6月龄无角牦牛在相同管理条件下自然放牧至18月龄，整个试验期间无角牦牛于天然牧场自由行走、采食、饮水，分别测定并记录12、18月龄时无角牦牛的生长性状。

1.2 无角牦牛血液DNA的提取及保存

按照OMEGA BIO-TEK血液基因组DNA提取试剂盒说明书操作流程进行基因组DNA的提取，经Thermo Fisher Scientific公司(美国)的NanoDrop 2000分光光度计检测合格后，于-20 ℃保存备用。

1.3 无角牦牛Hesx1基因的引物设计及PCR扩增

根据NCBI中野牦牛的Hesx1基因序列(GenBank登录号为NW_005392951.1)，分别将Hesx1基因的5′UTR、4个外显子及部分内含子、3′UTR依次命名为hⅠ—hⅥ，然后对hⅠ与hⅡ基因座进行引物设计(表1)，引物由西安擎科泽西生物公司合成。PCR反应体系为20 μL：超纯水7 μL，2×Pfu PCR MasterMix(不含染料)10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。PCR的扩增条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃或57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测后保存备用。

1.4 无角牦牛Hesx1基因的PCR-SSCP检测和DNA片段测序

将变性缓冲液(98%去离子甲酰胺、0.025%二甲苯青、0.025%溴酚蓝、0.037% Na2EDTA)与PCR产物按7∶3的比例加入离心管中(置于冰中)，振荡混匀后于98 ℃金属浴变性10 min，然后迅速置于冰中10～15 min。在4 ℃恒温箱中于150～170 V电压下进行10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳4～6 h，然后使用银染法进行基因型判定，最后将不同带型的PCR产物送至生物公司进行测序。

表1 Hesx1基因多态性检测引物Tab.1 Primers used to detect polymorphism of Hesx1 gene

1.5 数据分析

根据PCR-SSCP检测结果，对多态基因座的不同基因型进行统计分析。测序结果用Lasergene软件包里的Seq-Man进行序列对比。基因型频率、等位基因频率、杂合度、有效等位基因频率及多态信息含量等群体遗传参数用POPGENE和PCI-CALC等分析软件进行计算。用卡方检验进行哈代-温伯格平衡的计算。生长性状的关联分析用SPSS 20.0进行处理。

2 结果与分析

2.1 无角牦牛Hesx1基因的PCR扩增

分别设计引物对无角牦牛Hesx1基因的hⅠ与hⅡ基因座序列进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测后，分别得到272 bp和463 bp的目的片段，与预期大小相符，条带清晰且没有拖带，特异性良好(图1A和图1B)，均可直接进行PCR-SSCP分析。

M：DL600 DNA Marker；1—5：无角牦牛Hesx1基因hⅠ和hⅡ基因座的PCR扩增产物

2.2 无角牦牛Hesx1基因的SSCP检测

由图2可知，PCR扩增产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后显示，无角牦牛Hesx1基因hⅠ与hⅡ基因座均检测出2种带型，分别命名为GG、GC与TT、TC。

图2 无角牦牛hⅠ(A)和hⅡ(B)基因座不同基因型的电泳分析Fig.2 Electrophoresis analysis of different genotypes of hⅠ(A) and hⅡ(B) loci in polled yak

2.3 无角牦牛Hesx1多态基因型测序

将不同带型的PCR产物进行测序，结果在NCBI(GenBank)中与野牦牛Hesx1基因的序列进行比对后发现，无角牦牛Hesx1基因hⅠ基因座中(位于5′UTR中的第-618位)发生单个碱基突变：G→C(图3A和3B)，hⅡ基因座中(位于Intron 1中的第+226位)发生单个碱基突变：T→C(图3C和3D)。

A：GC基因型测序；B：GG基因型测序；C：TT基因型测序；D：TC基因型测序

2.4 无角牦牛Hesx1基因遗传多态性分析

如表2所示，无角牦牛Hesx1基因hⅠ基因座中基因型频率大小为GG>GC；hⅡ基因座中基因型频率大小为TT>TC。通过卡方检验可知，牦牛群体显著偏离哈代-温伯格平衡(P<0.05)。无角牦牛Hesx1基因hⅠ与hⅡ基因座的遗传多态性见表3，PIC含量分别为0.296与0.348，均为中度多态性(0.25

表2 无角牦牛Hesx1基因hⅠ与hⅡ基因座的基因型频率和等位基因频率Tab.2 Genotype frequency and allele frequency of hⅠ and hⅡ loci of Hesx1 gene in polled yak

注：括号内表示个体数，*表示显著偏离哈代-温伯格平衡(P<0.05)，**表示极显著偏离(P<0.01)。

Note: The number of individuals is shown in parentheses, * indicates a significant deviation from the Hardy-Weinberg equilibrium (P<0.05), and ** indicates a very significant deviation from the Hardy-Weinberg equilibrium (P<0.01).

表3 无角牦牛Hesx1基因hⅠ与hⅡ基因座的遗传多态性Tab.3 Genetic polymorphism of hⅠ and hⅡ loci of Hesx1 gene in polled yak

注：PIC>0.5为高度多态，0.25

Note: PIC>0.5 is highly polymorphic, 0.25

2.5 无角牦牛Hesx1基因多态基因座与生长性状关联分析

由表4可知，对Hesx1基因hⅠ基因座与无角牦牛3个月龄的生长性状进行关联分析发现，hⅠ基因座对6月龄无角牦牛的体质量、体高、胸围均有极显著影响(P<0.01)，且均为杂合GC型极显著大于纯合GG型的个体，但对体斜长影响不显著(P>0.05)；对12月龄无角牦牛的体质量有显著影响(P<0.05)，杂合GC型显著大于纯合GG型的个体，对体斜长、胸围均有极显著影响(P<0.01)，杂合GC型均极显著高于纯合GG型的个体；对18月龄无角牦牛的体质量有显著影响(P<0.05)，杂合GC型显著大于纯合GG型的个体，对体高、体斜长、胸围均无显著影响(P>0.05)。对Hesx1基因hⅡ基因座与无角牦牛3个月龄的生长性状关联分析可知，hⅡ基因座对6月龄无角牦牛的体质量、体高、体斜长、胸围均无显著影响(P>0.05)；对12月龄无角牦牛的体质量有极显著影响(P<0.01)，且杂合TC型极显著大于纯合TT型的个体，对体高、胸围均有显著影响(P<0.05)，且杂合TC型显著高于纯合TT型的个体，对体斜长无显著影响(P>0.05)；对18月龄无角牦牛的体质量、体高、体斜长、胸围均无显著影响(P>0.05)。因此，在hⅠ、hⅡ基因座中杂合型GC、TC个体生长性状优于纯合型个体，为优势基因型，对无角牦牛的生长性状有一定的正面影响。

表4 无角牦牛Hesx1基因hⅠ与hⅡ基因座不同基因型与生长性状的关联分析Tab.4 Correlation analysis between different genotypes of hⅠ and hⅡ loci of Hesx1 gene and production traits in polled yak

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note: In the same column of data,there are significant differences when marked in different lowercase (P<0.05) and different uppercase (P<0.01).

3 结论与讨论

Hesx1是动物前脑与脑垂体早期发育的重要转录因子，而垂体前叶是调控动物生长发育、内环境稳定及生殖的重要调节中枢，突变个体常表现为GH、FSH、LH、ACTH等的缺乏[16]，其中GH直接关系到动物的生长，因此，Hesx1基因对动物的生长性状有重要的影响。通过PCR-SSCP与DNA测序技术对秦川牛、南阳牛、郏县红牛、中国荷斯坦奶牛4个品种的Hesx1基因编码区全部外显子及部分内含子、5′UTR与3′UTR进行检测，在5′UTR、Intron1和第四外显子中各发现1个SNP，并且只在秦川牛、南阳牛、郏县红牛这3个群体中，在中国荷斯坦奶牛中并未发现；对有SNP的3个基因座与生长性状关联分析发现，5′UTR突变点对3个地方品种牛的生长性状没有显著影响，但Intron1突变点对18月龄南阳牛的日增体质量有显著影响，且野生型(TT)个体显著大于突变型(TC)个体，而第四外显子突变点对郏县红牛的胸围、体质量、体斜长有显著影响，且野生型(TT)个体显著大于突变型(TA或AA)，对6月龄南阳牛的体质量和平均日增体质量、12月龄南阳牛的体质量和胸围有显著影响，且野生型(TT)个体显著或极显著大于突变型(AA)，对秦川牛的十字部高、腰角宽、胸围及体质量有显著影响，且野生型(TT)个体显著大于突变型(AA)个体[2,17-18]。蓝贤勇等[19]利用混合DNA池测序技术，对山羊(包括6个品种1 391个个体)Hesx1基因的全部外显子位点进行测序，扫描SNP位点，然后利用酶切技术分出不同品种的基因型，在此基础上再通过关联分析得出，Hesx1基因对西农萨能奶山羊的体高、体长、胸围无显著影响；对内蒙古绒山羊的绒厚、绒长、产绒量无显著影响；但对山羊的体质量有显著影响，且2、4岁山羊的AA基因型个体显著大于AG型的个体。

本研究通过PCR-SSCP和DNA测序技术检测分析了无角牦牛Hesx1基因hⅠ与hⅡ基因座的多态性，通过与无角牦牛3个不同月龄的生长性状进行关联分析发现，突变杂合型GC与TC均为优势基因型，对无角牦牛的生长性状具有一定的正面影响。初步推断，Hesx1基因的hⅠ和hⅡ基因座可为牦牛的分子标记辅助育种提供参考，但也需要进一步扩大试验群体的数量并增加对Hesx1基因其他多态位点的深入研究，以期为肉用牦牛的品种选育提供更加丰富的理论依据。