双阴性T细胞对抗中性粒细胞胞质抗体 相关性血管炎的影响*

张娜，郭珲，罗静

（山西医科大学第二医院 1.肾内科，2.风湿科，山西 太原 030001）

抗中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎（associated vasculitis, AAV）是一种累及全身小血管的自身免疫性血管炎，其特征为坏死性小血管炎性损伤[1]。近年来，对AAV的发病机制研究多集中于CD4+T或CD8+T 细胞亚群的紊乱对AAV的影响[2-3]，而对CD4-CD8-T 细胞研究很少。双阴性T细胞（double-negativ T cells, DNT）即CD3+CD4-CD8-T细胞，是近年新发现的T细胞亚群，其细胞表面不表达CD4分子和CD8分子，可分泌多种细胞因子，在多种疾病中发挥作 用[4]。本研究通过检测AAV患者外周血中DNT细胞的比例及其胞内因子白细胞介素17（Interleukin-17, IL-17）、白细胞介素4（Interleukin-4, IL-4）及γ干扰素（Interferon-γ, IFN-γ）的水平，探讨DNT在AAV发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年9月—2018年9月山西医科大学第二医院就诊的50例AAV患者（AAV组）。伯明翰评分＜0分为活动组34例，伯明翰评分=0分为缓解组16例。活动组：男性20例，女性16例；年龄41岁（22～64岁）。缓解组：男性8例，女性6例；年龄43岁（23～66岁）。按照有无肾损害分为肾损害组32例和非肾损害组18例。肾损害组：男性18例，女性14例；年龄42岁（22～66岁）。非肾损害组：男性10例，女性8例；年龄43岁（21～66岁）。肾损害组患者经肾穿刺活检证实符合AAV肾损害的病理改变。同期招募30例健康志愿者作为对照组。其中，男性17例，女性13例。年龄44岁（20～67岁）。纳入标准：①AAV患者符合2012年美国Chapel Hill共识会议关于显微镜下多血管炎、肉芽肿性血管炎或嗜酸性肉芽肿性多血管炎的定义及分类标准[5]；②患者初次诊断为AAV，未接受糖皮质激素及免疫抑制治疗。排除标准：①严重感染疾病；②系统性红斑狼疮、干燥综合征及类风湿关节炎等其他自身免疫性疾病；③血液疾病或最近2个月输过血；④恶性肿瘤；⑤重大精神疾病。本研究通过本院伦理委员会批准（2016KY007），患者及其家属签署知情同意书。两组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器和试剂流式细胞仪FACS Canto Ⅱ购自美国BD公司，叶绿素（PerCP）标记的CD3抗体、异硫氰酸荧光素（fluorescein isocyanate, FITC）标记的CD4抗体、藻红蛋白（P-phycoerythrin, PE）标记的CD8抗体、别藻蓝素（Allophycocyanin, APC）标记的IL-17抗体、PE标记的IL-4抗体、FITC标记的IFN-γ抗体、APC标记的鼠免疫球蛋白G1（Immunoglobulin G, IgG1）同型对照抗体、PE标记的兔免疫球蛋白G2b（Immunoglobulin G2b, IgG2b）、k同型对照抗体、FITC标记的兔IgG1、k同型对照抗体购自美国BD公司，佛波酯和离子霉素购自美国Sigma公司，溶血素购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2.2 细胞培养在所有纳入患者知情的情况下，采集静脉血2～3 ml，并使用肝素抗凝，与IMDM培养基按1∶1充分混匀，加入20 ng/ml佛波酯和1μmol/L 离子霉素联合刺激；同时加入2μmol/L蛋白质转运抑制剂进行阻断。充分混合后，在37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中培养5 h。

1.2.3 细胞染色取100μl全血于流式管中，同时加入PerCP标记的CD3、FITC标记的CD4及PE标记的CD8抗体各10μl进行表面染色，同时设置同型对照管，室温避光孵育20 min。加入1 ml溶血素，孵育10 min，2 ml缓冲液洗涤后1 000 r/min离心5 min弃上清。再于每管加入500μl 4%多聚甲醛进行固定，20 min后1 000 r/min离心5 min弃上清，每管分别加入含0.1%皂素的缓冲液2 ml进行破膜，10 min后1 000 r/min离心5 min弃上清。之后进行胞内染色，加入APC标记的IL-17、PE标记的IL-4及FITC标记的IFN-γ抗细胞因子抗体及相应的同型对照抗体各0.1μl，孵育30 min后用2 ml含0.1%皂素的缓冲液洗涤，1 000 r/min离心5 min弃上清。最后每管加入磷酸缓冲盐溶液2%多聚甲醛重悬细胞。

1.2.4 流式细胞术检测完成染色的细胞用流式细胞仪进行检测。每一样品检测20 000个细胞，并使用FlowJo V.7.6.1软件进行数据分析。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，相关性分析用Spearman法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组DNT、IL-17、IFN-γ及IL-4表达水平比较

活动组、缓解组与对照组DNT、IL-17、IFN-γ及IL-4水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；活动组及缓解组DNT、IL-17及IFN-γ较对照组高（P＜0.05）；而IL-4较对照组低（P＜0.05）；活动组DNT、IL-17较缓解组高（P＜0.05）；活动组IL-4、IFN-γ与缓解组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 肾损害组与非肾损害组DNT、IL-17、IFN-γ及IL-4水平比较

肾损害组与非肾损害组DNT、IL-17水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；肾损害组DNT、IL-17较非肾损害组高（P＜0.05）；肾损害组与非肾损害组IL-4、IFN-γ比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 AAV患者DNT及胞内因子与临床指标的相关性分析

AAV患者DNT与红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate, ESR）、伯明翰评分、血清肌酐（serum creatinine, Scr）、抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA）滴度24 h尿蛋白水平呈正相关（P＜0.05）；IL-17与Scr、24 h尿蛋白呈正相关（P＜0.05）；而IL-4、IFN-γ与各项临床指标无相关性（P＞0.05）。见表3。

表1 3组DNT、IL-17、IFN-γ及IL-4水平比较（±s）

表1 3组DNT、IL-17、IFN-γ及IL-4水平比较（±s）

组别nDNT/%IL-17/（pg/ml）IFN-γ/（pg/ml）IL-4/（pg/ml）对照组300.953±0.3240.853±0.2421.052±0.3843.025±0.673缓解组162.284±0.4752.244±0.4712.649±0.5561.152±0.712活动组344.537±0.8524.342±1.1832.875±0.6751.256±0.328 F值267.044149.00493.546 97.695 P值0.0000.0000.000 0.000

表2 肾损害组与非肾损害组DNT、IL-17、IFN-γ及IL-4水平比较（±s）

表2 肾损害组与非肾损害组DNT、IL-17、IFN-γ及IL-4水平比较（±s）

组别nDNT/%IL-17/（pg/ml）IFNγ/（pg/ml）IL-4/（pg/ml）肾损害组324.322±0.8424.842±1.1832.949±0.5562.573±0.857非肾损害组182.153±0.3281.944±0.4713.083±0.6632.594±0.465 t值10.4539.9240.763 0.096 P值0.0000.0000.449 0.924

表3 AAV患者临床指标与DNT及胞内因子的相关性分析

3 讨论

AAV是一种自身免疫性疾病，可累及全身的小动脉、小静脉和毛细血管，进而引起多脏器、多系统损伤，其中肾脏受累率最高[1]。DNT在多种自身免疫性疾病[6]、移植排斥[7]、肿瘤免疫[8]及感染性疾病[9]中发挥重要作用。本研究发现，AAV活动组患者外周血DNT水平高于缓解组和对照组，提示DNT细胞参与AAV的发病进程，并影响疾病的活动度。MARTINA等[10]研究发现，DNT在早期急性肾损伤患者的外周血中增加，且沉积于损伤的肾组织中。本实验也证实AAV肾损害组DNT水平高于非肾损害组，提示DNT与AAV肾损害有相关性。

DNT可通过分泌多种胞因子参与疾病进程[11]。一般来说，IL-17主要由Th17细胞分泌，其能诱导组织中多种炎症细胞因子和趋化因子的表达，导致中性粒细胞在炎症组织中的浸润，参与AAV的发病进程[12]。CRISPÍN等[13]发现，系统性红斑狼疮患者中，IL-17主要由DNT产生，并沉积于肾组织中，促进狼疮肾炎的发病进程。ALUNNO等[14]发现，DNT在原发性干燥综合征患者外周血中增加，且98%～100% DNT都表达Th17细胞的特异性转录因子视黄酸孤儿核受体（RORγt），并分泌大量IL-17。本研究也发现，AAV活动组患者DNT分泌的IL-17水平较缓解组和对照组升高，且肾损害组较非肾损害组IL17升高，由此猜测DNT可能通过分泌IL-17加重疾病进程，参与肾脏的损害。

一般来说，IFN-γ主要由Th1细胞产生，可上调免疫反应，促进中性粒细胞浸润和局部肉芽肿的形成，在AAV发病机制中发挥重要作用[15]。IL-4主要由Th2细胞产生，能下调免疫反应，维持免疫耐受。FISCHER等[16]发现，刺激DNT后其分泌的IFN-γ水平是CD4+T细胞分泌IFN-γ的3～4倍；MÜLLER等[15]发现，韦纳肉芽肿患者外周血中IFN-γ的水平升高，IL-4降低。本实验表明，AAV患者外周血DNT分泌的IFN-γ水平升高，IL-4减少，提示DNT可能通过诱导IFN-γ及IL-4分泌紊乱，进而促进AAV的疾病进程，同时也使免疫反应向促炎性细胞Th1型偏斜。但在活动组与缓解组、肾损害组与非肾损害组的AAV患者中，DNT内IL-4、IFN-γ的水平比较无差异，猜测DNT分泌的IL-4和IFN-γ可能只参与AAV发病的始动过程，而对其疾病活动度和肾功能损害无影响。

相关性分析发现，AAV患者DNT与ESR、伯明翰评分呈正相关，两者能从整体反映疾病活动度，猜想DNT可影响AAV疾病的活动性。而DNT及其分泌的IL-17与反映肾脏功能的指标，如Scr、24 h尿蛋白水平呈正相关，提示DNT及其分泌的IL-17可能参与AAV患者的肾脏损害，也证实本文前述的观点。

综上所述，DNT在AAV的发病机理中起一定作用，且与肾脏损害关系密切。通过对DNT研究可能对AAV的诊断、疾病活动程度的监测以治疗提供一定的依据，但本实验也有一定的局限性，首先纳入病例的数量相对较少；同时并未对DNT细胞的影响机制进行更深入的探讨，因此需要后期进行更大规模、更深入的临床研究。