p21 codon31基因多态性与宫颈癌的关系

郭海燕，杨少迪，蒋佩

（1.西安市第四医院 妇产科，陕西 西安 710004；2.中南大学基础医学院 生物医学工程系，湖南 长沙 410083；3.娄底职业技术学院医学院，湖南 娄底 417000）

宫颈癌是发展中国家女性癌症病死率的首要因素，其风险因素包括性行为、饮食、人乳头状瘤病毒感染及遗传基因等[1-2]。有研究表明，癌基因的激活及抑癌基因的失活与宫颈癌的形成有相关性[3-6]。因此，遗传因素成为研究宫颈癌发生、发展机制的热点。目前国内外研究表明，p21 codon31基因多态性与肿瘤具有相关性，但结果存在很大的差异[7-8]。本文针对p21codon31基因多态性与中国汉族人群宫颈癌患者的统计学、发病风险及临床病理学参数的关系进行 研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取2014年1月—2016年6月陕西西安及湖南地区汉族宫颈癌患者178例作为研究组，并选取相同时间和地点的237例健康群众作为对照组。采集对照组外周静脉血样本，分装在抗凝管并于-80℃冰箱内保存。同时，记录研究对象的详细临床资料。其中，对照组均通过巴氏涂片和阴道镜等检查，排除宫颈癌和癌前病变的可能性。碘化钾、硼酸、浓盐酸、无水乙醇、氯仿、氯化钠及溴化乙锭均购自北京化学试剂公司，异丙醇、异戊醇、乙二铵四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）、Tris饱和酚、聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）相关试剂、Marker DL100 ladder及PCR引物序列合成均购自上海生工生物工程有限公司，BlpI内切酶购自英国New England Biolabs公司，琼脂糖购自西班牙Biowest公司，所有试剂均在有效期内按说明书 使用。

1.2 实验仪器

基因扩增仪购自美国MJ公司，电泳仪购自北京六一仪器厂，凝胶成像仪购自北京五洲东方科技发展有限公司。

1.3 DNA提取

采用标准蛋白酶K消化和酚/氯仿法抽提研究对象的EDTA抗凝外周静脉血样本的DNA，提取后于TE缓冲液中溶解，-20℃保存。

1.4 限制性片段长度多态性分析

取上述DNA模板进行限制性片段长度多态性分析（polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP）[9]，PCR引物序列见表1。其中，PCR反应体系15μl，包括DNA模板1.0μl，p21正向引物（10μmol/L）1.0μl，p21反向引物（10μmol/L）1.0μl，dNTP（10 mmol/L）0.5μl，10×PCR缓冲液2.5μl，MgCl2（25 mmol/L）1μl，TaqDNA聚合酶（5 u/μl）0.2μl，ddH2O 7.8μl。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性40 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35个循环，72℃继续延伸10 min，取出4℃保存。

表1 p21 codon31基因引物序列

取上述PCR扩增产物7.5μl，10×酶切缓冲液1.5μl，ddH2O 5.5μl，限制性内切酶BlpI0.5μl，酶切反应体系在37℃过夜恒温培育，取出放置4℃条件下保存。

1.5 测序

采用2%琼脂糖凝胶电泳法统计每个样本的基因分型结果，并抽取p21 codon31不同基因型的PCRRFLP产物送至上海生工生物工程公司进行测序验证。见图1、2。

图1 琼脂糖凝胶电泳图

图2 p21 codon31 3种基因型PCR产物测序图

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件。计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组人口学因素分析

两组年龄、饮酒及家族史比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。两组吸烟史比较，差异有统计学意义（P＜0.05），研究组吸烟比例高于对照组。见表2。

2.2 两组p21 codon31基因型和等位基因分布比较

PCR-RFLP分析后，p21 codon31精氨酸（Arginine, Arg）等位基因片段为272 bp；丝氨酸（Serine, Ser）等位基因被酶切成183和89 bp 2个片段；Arg/Ser杂合子形成272、183及89 bp 3个片段。两组p21 codon31基因Ser/Ser基因型频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），研究组高于对照组。两组p21 codon31基因Arg/Ser基因型频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。两组p21 codon31基因Ser等位基因比较，差异有统计学意义（P＜0.05），对照组高于研究组。见表3。

2.3 p21 codon31基因多态性与宫颈癌风险的 关系

在Logistic回归分析中，p21 codon31基因多态性与宫颈癌风险相关。p21 codon31基因Ser等位基因携带者患宫颈癌风险是Arg等位基因携带者的1.345倍（95% CI：1.020，11.772），P=0.035]；p21 codon31基因Ser/Ser基因型携带者患宫颈癌风险是Arg/Arg基因型携带者的2.01倍（95% CI：1.106，3.654，P=0.021]。

2.4 基因多态性与宫颈癌临床病理特征的关系

不同宫颈癌组织类型、临床分期、淋巴结转移及肿瘤大小的p21 codon31基因多态性比较，经χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表2 两组一般资料比较 例（%）

表3 两组p21 codon31基因型和等位基因分布比较 例（%）

表4 宫颈癌患者不同影响因素p21 codon31基因多态性比较 例（%）

续表4

3 讨论

p21基因定位于人类染色体6p21.2。p21基因编码一种有效的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，编码的蛋白结合并抑制CDK2或CDK4复合物的活性[10-12]。p21基因的表达受肿瘤抑制蛋白p53的严格控制，该蛋白通过p53介导多种应激刺激下的p53依赖性细胞周期G1期阻滞[13-16]。该蛋白可与增殖细胞核抗原相互作用，在G1/S期DNA复制、DNA损伤修复或细胞凋亡中发挥调控作用。因此，p21基因在抑癌过程中起着重要作用，但关于p21基因突变的报道甚少。其中，p21基因最常见的单核苷酸多态性发生在第31位密码子（codon31），碱基从AGC突变到AGA（C→A），氨基酸从Ser转变为Arg[17]。p21 codon31基因是唯一发生在编码区内的突变，该多态性位点参与肿瘤发生、发展机制的调控。

LIMA等[9]的研究表明，在巴西人群中研究组与对照组的基因型比较有差异，且携带p21 codon31基因Ser/Ser基因型的研究组与对照组比较，宫颈癌病变风险增加了2.41倍。MA等[18]的研究表明，在亚洲人群中p21 codon31基因多态性与宫颈癌无显著相关性，但在白种人群里不同基因型与宫颈癌的关系还需要进一步研究。

本研究与LIMA等[7]的结果一致，p21 codon31基因Ser/Ser基因型患宫颈癌风险比对照组高约2倍，p21 codon31基因多态性与中国汉族人群宫颈癌的发病风险有相关性。

综上所述，本研究在统计学及临床病理特征的研究结果显示，p21 codon31基因多态性与吸烟有关。同时，针对中国汉族人群的结果表明，p21codon31基因多态性与宫颈癌的遗传易感性有关。目前关于p21 codon31基因多态性的研究较少，可在不同国家不同人群及种族中进一步扩大样本量进行研究。