SPF大鼠感染金黄色葡萄球菌原因的调查分析

黄伟峰， 黄玉兰， 刘丽， 张林， 吕虹， 雷高鹏， 李莉， 刘科亮， 杨小蓉

(四川省疾病预防控制中心，成都610041)

随着生命科学的迅速发展，实验动物作为生命医学研究的重要支撑条件(张越华，郑秀青，2017)，其安全性和有效性越来越受到高度关注。按微生物、寄生虫控制程度，实验动物可分为4个等级，即普通动物、清洁动物、无特定病原体(specific pathogen free，SPF)动物和无菌动物(魏杰等，2014)。SPF动物是指除清洁动物应排除的病原外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的实验动物(田攀，2016)。实验动物感染病原体后在实验过程中发病或死亡，影响生理指标，干扰实验结果的可靠性和准确性，导致实验失败。由于对实验动物质量的要求越来越高，许多生命科学研究要求使用SPF级及以上等级。

但实验动物饲养与实验过程中外界环境的污染难以避免(姜光瑶等，2010)，实验动物感染病原体的报道屡见不鲜。金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus(SA)是一种广泛分布于环境中的革兰氏阳性球菌，存在于空气、土壤、水及物品上，在人和家畜的体表尤其在和外界相通的腔道中检出率相当高，也是实验动物最常见的易感病原体(邹自英等，2014)。为确保实验动物质量、避免污染，查找金黄色葡萄球菌的来源和分析污染链，本实验室连续多年对某实验动物饲养场进行了监测和分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基与试剂7.5%氯化钠肉汤、高盐甘露醇琼脂(SP)平板、血琼脂平板、脑心浸出液肉汤、冻干兔血浆。

1.1.2 主要仪器全自动微生物生化鉴定仪VITEK 2 COMPACT系统(法国Biomerieux公司)、Veriti梯度PCR仪(美国ABI公司)、QIAxcel毛细管电泳仪(德国Qiagen公司)、脉冲场电泳仪(美国伯乐公司)、凝胶成像系统(美国伯乐公司)、水浴摇床(英国Grand公司)。

1.2 方法

1.2.1 标本采集2011—2017年共采集该实验动物饲养场的SPF大鼠回盲肠内容物35份；2017年采集实验动物养殖室空气自然沉降样本2份，饲养人员鼻腔拭子8份，饲养人员手部涂抹拭子8份。

1.2.2 分离纯化根据《实验动物 金黄色葡萄球菌检测方法(GB/T 14926.14-2001)》，标本直接划线接种到SP平板、血琼脂平板，36 ℃培养24 h，金黄色葡萄球菌在SP培养基上形成黄色菌落，在血琼脂平板形成灰白色、周围有β溶血环的菌落。挑出可疑菌落，进行全自动生化鉴定和血浆凝固酶实验。鼻腔拭子、手部涂抹拭子根据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验(GB 4789.10-2016)》进行处理。

1.2.3 金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcusprotein A， SPA)基因分型挑取金黄色葡萄球菌菌苔，用煮沸法提取DNA，PCR检测SPA基因300～400 bp序列片段(Monacoetal.，2010)，引物F：5’-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3’，R：5’-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3’。反应体系为：上下游引物各1 μL、dNTP 4 μL、10×Buffer 5 μL、TaKaRa酶 0.3 μL、模板3 μL，无菌纯水加至50 μL，混匀，离心。扩增条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。用毛细管电泳检测PCR产物，并对阳性结果进行双向测序。

1.2.4 脉冲场凝胶电泳(PFGE)实验金黄色葡萄球菌PFGE标准分型方法参考美国CDC网站的方法(Centers for Disease Control and Prevention，2011)。取新鲜琼脂纯培养的金黄色葡萄球菌悬浊于TE中，调节麦氏浓度至4.2～4.4。菌悬液加入溶葡萄球菌酶与等体积1% Seakem Gold琼脂混合制作plug。然后置于含蛋白酶K的细胞裂解液中裂解2 h，再用TE清洗干净。切2 mm宽胶块用 Sma Ⅰ内切酶酶切；标准菌株H9812用Xba Ⅰ内切酶酶切。电泳条件为最小分子量40 kb、最大分子量400 kb，初始脉冲4.0 s、终末脉冲40.0 s，泵速设为70，电泳温度14 ℃，电压梯度6 V·cm-1，电场夹角120°，电泳时间19 h 30 min。结束后用0.1 μg·mL-1Gelred染色30 min，纯水中脱色30 min，凝胶成像仪上读取图像并保存。

1.2.5 聚类分析方法使用BioNumerics 6.6进行数据分析。用不加权算术平均组对法(UPGMA)对PFGE指纹图谱进行聚类分析(杨小蓉等，2014)；用最大似然法对SPA测序结果进行聚类分析。

2 结果

2.1 SPF大鼠中金黄色葡萄球菌检出率

2011—2017年(2014、2016年未采集)采集的35份样本检出16株SA，检出率45.71%。除2015年外，每年均从SPF大鼠中检出SA，检出率为2012年最低(20.00%)，2017年最高(100.00%)，2011、2013年均为60.00%(表1)。

表1 2011—2017年SPF大鼠中金黄色葡萄球菌检出情况Table 1 Detection of Staphylococcus aureus in SPF rats during 2011-2017

2.2 饲养环境及饲养人员检测结果

从采集的18份饲养环境及饲养人员样本中检出2株SA。其中，1份饲养环境空气中检出1株，1份饲养人员鼻腔拭子中检出1株，饲养人员手部涂抹拭子中未检出。

表2 饲养环境及饲养人员金黄色葡萄球菌检出情况Table 2 Detection of Staphylococcus aureus inbreeding environment and rearing staff

2.3 SPA分型结果

该饲养场检出的18株SA可分成5个SPA基因型别，T2360为主要型别(11株)，各菌株SPA型别见表3。对SPA测序结果用最大似然法进行聚类分析，5个SPA型别可以聚为4簇，聚类关系与分离年份有很强的相关性：2011年SPF大鼠的3株SA为T3022，与其他SPA型别的亲缘关系较远；2012年SPF大鼠的2株SA为T237；2013年和2017年SPF大鼠的11株SA都为T2360。虽然饲养场环境空气中检出菌株的SPA型别为T9001，但与来源于SPF大鼠的T2360聚为同一簇。饲养人员鼻腔检出菌株的SPA型别为T127(图1)。

图1 18株金黄色葡萄球菌的SPA分型聚类分析Fig. 1 SPA typing of 18 Staphylococcus aureus strains

表3 18株金黄色葡萄球菌SPA分型结果Table 3 The result of SPA typing of 18 Staphylococcus aureus strains

图2 18株金黄色葡萄球菌的PFGE分型聚类分析
Fig. 2 PFGE typing of 18Staphylococcusaureusstrains

2.4 PFGE分型结果

18株SA的PFGE有5个带型，命名为SA1～SA5，可聚为2大类，一类由SA1和SA2组成，另一类由SA3～SA5组成；SA4为主要带型，有11株SA。不同年份SPF大鼠中分离SA的PFGE带型有明显的差异：2011年、2012年的PFGE带型与2013年、2017年差异较大；且2011年只有SA1一个带型，2012年只有SA2一个带型；2013年为SA3和SA4，2017年为SA4。饲养环境空气、饲养人员中分离SA的PFGE带型与SPF大鼠中SA的相似度分别为100.00%、86.90%。

3 讨论

近年来，实验动物中携带病原微生物多有报道，葛文平等(2012)检测了5个单位不同品系SPF小鼠，发现其SA、肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae和铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa的携带率分别为1.875%、1.875%和1.250%；冯洁等(2015)在422只SPF小鼠中，SA、肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌的分离率分别为2.37%、0.47%和5.21%；Nobuhito等(2013)发现上千只动物和样本中SA感染率比其他病原体更高，小鼠为18.8%，大鼠为58.6%。本研究对某实验动物饲养场SPF大鼠进行SA连续多年监测，检出率达45.71%，与Nobuhito等(2013)的报道较为一致。

SPA分型方法主要是基于对SPA基因X区域可变串联重复序列(VNTRs)的多态性序列分析，由于编码SPA的基因包含一定数目的24 bp重复序列，根据重复序列的数目、特征及排列顺序不同而具有高度的多态性，且具有良好的重复性和稳定性，适合分型(谭磊等，2008)。PFGE被认为是细菌分子分型的“金标准”，目前已被广泛应用于检测不同来源菌株之间的关联性(闫笑梅等，2009)。本研究运用这2种方法对分离株进行聚类分析，发现同一年份分离株的PFGE和SPA型别均一致，说明同一年份分离株来自同一克隆系，不同年份的分离株之间亲缘关系与分离年份相关性很强，且各年份分离SA的PFGE和SPA型别基本一一对应。T2360和T9001的SPA基因前面5个重复序列一致，且其SPA序列能够聚为同一簇，说明有这2个型别的菌株亲缘关系非常近，可能是SPA基因X区域的碱基突变导致从第6个重复序列发生改变而型别不一致。这也解释了饲养环境空气中分离的SA菌株2017043，虽然其SPA型(T9001)与SPF大鼠中的T2360不一致，但其PFGE带型与2013年和2017年SPF大鼠中的均为同一带型(SA4)，这与SPA聚类分析结果一致，说明2017年饲养环境空气中分离的SA菌株与2013、2017年分离的SA菌株亲缘关系很近，有可能来自同一克隆株。同样，2013年SPF大鼠中的SA有2个PFGE带型(SA3和SA4)对应了同一个SPA型别(T2360)，但SA3与SA4的相似度为90.90%，亲缘关系较远，说明这一批SPF大鼠可能感染了不同来源的SA。

本研究结果推断，饲养环境空气中分离的SA与引起SPF大鼠感染的SA具有紧密联系，很可能是引起SPF大鼠感染的污染源。当然并不能忽视其他因素也有可能引起的实验动物感染，比如引进受感染的种鼠或幼鼠未被检出、饲养人员携带的病原微生物等。在饲养人员鼻腔拭子也分离到了SA菌株2017044，虽然其SPA型别与SPF大鼠中的不一致，PFGE带型的相似度也仅为86.90%，不是引起本次实验动物感染的菌株，却是重要的潜在污染源。因此应保持实验动物饲养的无菌环境和工具清洁，加强动物密切接触者的无菌操作规范，对每批引进种鼠或幼鼠进行检测，并定期对饲养环境、饲养工具设备、饲养人员以及饲养动物进行病原微生物监测，及时发现隐患，找到污染源，切断传播途径，避免感染的发生，为实验动物的质量和饲养人员的健康提供保证。