大熊猫双胞胎生长发育影响因素的研究

王树群， 奉永友， 陈波， 吴孔菊， 方俊， 谢意， 黄祥明

(成都大熊猫繁育研究基地，濒危动物繁殖与保护遗传省重点实验室，成都610081)

大熊猫Ailuropodamelanoleuca是国家Ⅰ级重点保护野生动物，有“活化石”和“中国国宝”之称，属于食肉目Carnivora大熊猫科Ailuropodinae，虽然大熊猫幼仔初生体质量仅约为母体体质量的1/1 000，而体型相似的黑熊Ursusthibetanus幼仔的该比例为1/200～1/300(胡锦矗，2001)。经多年探索，圈养大熊猫营养和管理技术逐渐成熟，幼仔的存活率在2005年达79.8%(赵学敏，2006)，且2006年育活初生体质量最轻的大熊猫幼仔(黄祥明等，2011)。2018年《大熊猫保护与繁殖国际大会暨大熊猫繁育技术委员会年会》发布数据，全球圈养大熊猫种群数量达到548只。大熊猫双胞胎存活率也从45.5%(黄炎等，2001)提高到95%(王海瑞等，2015)。实践证明，养育存活的大熊猫双胞胎幼仔与单胎幼仔相比在生长、发育、繁殖能力上并无显著差异，所以双胞胎存活率的提高直接促进了整个圈养大熊猫种群繁殖效率的提高(王海瑞等，2015)。

虽然大熊猫双胞胎存活率不断提高，但是影响大熊猫双胞胎生长发育因素的报道极少，因此，通过大熊猫母兽孕期增重、双胞胎个体性别、双胞胎性别类型(双雄性、双雌性和异性)和大熊猫幼仔的初生体质量等方面综合分析研究大熊猫双胞胎个体生长发育规律的影响因素，不仅可以有效指导不同性别和初生体质量大熊猫幼仔与大熊猫母兽孕期的营养供给，而且还可以为大熊猫双胞胎幼仔生长发育的理论研究打下基础。

1 材料和方法

1.1 研究对象

以成都大熊猫繁育研究基地的22只母兽及其在2013—2016年繁育的22对大熊猫双胞胎(♂22，♀22)为研究对象，其中，2013年4对，2014年3对，2015年6对，2016年9对(表1)。

1.2 育幼管理

大熊猫双胞胎幼仔采用人工辅助育幼：在产仔当日取出其中一只人工喂奶、护理，每隔1～1.5 h与母兽哺育的另一只交换，保证每只幼仔及时吃到初乳，1～5 d内遵循先在母兽处吃乳，若未吃到再进行人工补喂母乳或者配奶(由美赞臣A+和美国PetAg 幼犬奶粉与水混合形成的浓度25%的配奶)的饲喂原则，若幼仔无法含住乳头，则人工将幼仔移到母兽乳头处；此外，根据每只幼仔体质量增长、食欲等每天随时调整返回母兽处的次数和补喂的人工配奶和母乳的数量；2～3月龄时每天早上将双胞胎中的一只补喂人工配奶而另一只回到母兽处吃母乳，待其吃好母乳后，将另一只也返回母兽处，5月龄后除了每天晚上喂1次人工配奶外，2只幼仔全天与母兽待在一起；具体人工辅助方法、环境控制等参考黄祥明等(2001，2005)的标准；此外，早期每天定时称量每只幼仔的体质量，3月龄后改为每晚称量1次；母兽体质量每月定时称量1次，母兽孕前体质量为母兽配种前的体质量，母兽分娩时体质量为母兽分娩前的体质量，母兽孕期增重=母兽分娩时体质量-母兽孕前体质量。

1.3 统计方法

母兽孕期增重、双胞胎个体性别和双胞胎性别类型与大熊猫双胞胎幼仔初生体质量之间的关系、不同双胞胎个体性别和不同初生体质量与不同月龄幼仔体质量之间的关系采用一般线性模型中的多变量方差分析。目前大熊猫母兽孕期增重尚无明确划分标准，但在人类孕妇的相关研究中以孕期增重低于10 kg视为增重不足(孙正芳等，2013)，因此，本研究以孕期增重10 kg为标准。

用双胞胎初生体质量差异程度(difference of birth mass，D)(张春丽，张宁，2012)表示1对双胞胎2只个体的初生体质量差异值，可直观表示出这 2只个体在母体内的生长发育情况，D=(Wmax-Wmin)×100/Wmax，其中，Wmax表示较大个体的体质量，Wmin表示较小个体的体质量。目前动物双胞胎初生体质量差异程度尚无明确的划分标准，但是人类双胞胎以初生体质量差异≥20%作为诊断标准(杨孜，2009)，因此，本研究采用20%作为初生体质量差异分界线，并对双胞胎性别类型和初生体质量差异程度进行Cramer’s V相关分析，而双胞胎初生体质量差异程度则用χ2检验进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义，同时以Post hoc testing检验调整后的标化残差判断各组的差异，当调整后标化残差的绝对值大于1.96时，差异有统计学意义。不同性别类型双胞胎的平均初生体质量采用单因素方差分析。

表1 22对大熊猫双胞胎幼仔基本信息Table 1 Basic information of 22 giant panda twin cubs

所有数据均在SPSS 20.0中进行分析，结果以平均值±标准误表示。

2 结果

2.1 大熊猫双胞胎初生体质量

大熊猫幼仔初生体质量差异分析结果显示，双胞胎性别类型显著影响大熊猫幼仔初生体质量(P=0.015)，其中，双雌性双胞胎和异性双胞胎中较大个体的初生体质量显著大于较小个体(P<0.05)，但是母兽孕期增重(P=0.257)和双胞胎个体性别(P=0.170)却对大熊猫幼仔初生体质量无显著影响(表2)。

不同双胞胎性别类型的个体初生体质量差异程度不同(χ2=9.043，P=0.041)，且双胞胎性别类型与幼仔初生体质量呈中等强度相关关系(Cramer’s V=0.492，P=0.030)：双雌性双胞胎个体的初生体质量差异集中于20%～40%(调整后的标化残差：2.30)，极少低于20%(调整后的标化残差：-2.00)；双雄性双胞胎个体的初生体质量差异小于20%(调整后的标化残差：2.60)；异性双胞胎个体的初生体质量差异虽然没有统计学意义(调整后的标化残差：1.8)，但差异程度大于40%。双雌性双胞胎个体的平均体质量为0.13 kg±0.01 kg，双雄性的为0.15 kg±0.01 kg，异性的为0.14 kg±0.01 kg，但三者差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

2.2 大熊猫双胞胎幼仔1～12月龄的体质量

分析1～12月龄大熊猫双胞胎幼仔的体质量后发现，大熊猫幼仔个体性别、初生体质量及其交互作用对各月龄的体质量均无显著作用(P>0.05)(表4)。

表2 不同双胞胎性别类型、双胞胎个体性别和母兽孕期增重对大熊猫双胞胎幼仔体质量的影响Table 2 The effect of sex type of twins， individual sex and increasing of maternal gestational masson the birth mass of giant panda twin cubs

注： B. 双胞胎中较大个体， S. 双胞胎中较小个体；*双胞胎的初生体质量差异有统计学意义(P<0.05)

Notes： B. individual with greater birth mass in twins， S. individual with lesser birth mass in twins；*there is a significant difference between the twins’ birth mass (P<0.05)

表3 双胞胎个体的初生体质量差异Table 3 The difference of birth mass in twins

表4 不同双胞胎个体性别和初生体质量对大熊猫幼仔体质量的影响Table 4 The effect of individual sex and birth mass on the body mass of giant panda twin cubs

3 分析与讨论

3.1 双胞胎性别类型对大熊猫幼仔初生体质量的影响

目前，关于动物的双胞胎性别类型与初生体质量之间关系的报道极少，但在人类双胞胎中研究较多(Fieni & Gramellini，2004；杨孜，2009；张春丽，张宁，2012)。人类双胞胎初生体质量差异程度大于20%视为双胞胎生长不一致，因双胞胎类型(双卵双胞胎和单卵双胞胎)不同，双胞胎生长不一致的原因有所差异，其中双卵双胞胎生长不一致不仅有遗传学方面生长潜能差异的原因，还有2个胎盘之一未能够占据理想而有利的子宫内膜位置而得不到良好的血供和胎盘、系带及胎儿等先天畸形的原因，但最主要的原因则是胎盘灌注不足；单卵双胞胎生长不一致的原因则是由于胎盘间血管吻合所致的胎儿间血流不平衡和2个胎儿间胎盘分配不均或所属胎盘种植部位不当，导致的营养和氧气供应不均，从而使胎盘出现不均衡生长，而其中胎盘的氨基酸转运损害是最重要的因素(Fieni & Gramellini，2004；杨孜，2009)；因此，引起胎儿的营养供给差异是导致双胞胎生长不一致最直接的原因。

本研究中，双胞胎性别类型显著影响大熊猫双胞胎个体的初生体质量(P=0.015)。相较于人类双胞胎婴儿初生体质量的差异程度(女性双胞胎>异性双胞胎>男性双胞胎；张春丽，张宁，2012)，大熊猫双胞胎初生体质量差异程度表现为异性双胞胎>雌性双胞胎>雄性双胞胎，因此，大熊猫双胞胎中存在雌性个体时2只个体的初生体质量差异程度较大的现象与人类一致；原因可能是大熊猫双胞胎胎儿在母体内发育期间，怀双胞胎的母兽体内雌激素约为怀单胞胎母兽体内雌激素的1.5倍，处于极高水平(王海瑞等，2015)，而动物妊娠早期雌激素可以干预延缓子宫内膜螺旋动脉重塑，抑制滋养层细胞侵袭，使胎盘结构出现异常，并且高雌激素水平会增加低体质量儿的风险(王树芳，2015)，所以在高水平雌激素的胚胎期，雌性个体可能与另一个体竞争而影响其中一只个体胎盘的分配(布)、生长或结构，从而影响胎盘的营养供给和胎儿的生长发育。

3.2 双胞胎个体性别与大熊猫双胞胎幼仔初生体质量的关系

胎儿的生长发育受先天遗传因素和母体子宫内环境共同影响，而双胞胎共用1个子宫，这为研究胎儿发育提供了相对稳定的母体环境。刘定震等(2001)认为雄性大熊猫初生体质量较雌性大，而李明喜(2004)却认为雌性大熊猫初生体质量较雄性大；相较于大熊猫，众多学者研究了人类性别对婴儿初生体质量的影响，认为由于男性与女性遗传组成的差异，特别是Y染色体在对胎儿的体质量增长、形体发育、骨骼成熟和牙齿发育等方面可能存在的特别作用，从而使拥有XY染色体的男婴初生体质量比具有XX染色体的女婴更大(Žarkoetal.，1985；Glinianaiaetal.，2000；饶腾子等，2012)。在本研究中，大熊猫双胞胎个体性别对幼仔初生体质量未产生影响(P=0.170)，其原因可能是不同双胞胎性别类型2只个体间的差异无统计学意义(P>0.05)，所以不同性别类型双胞胎总体发育较为一致。此外，在人类双胞胎中，当异性双胞胎孕龄与女性双胞胎相近，但长于男性双胞胎时，异性双胞胎的女性个体初生体质量则同女性双胞胎相近，而异性双胞胎的男性个体初生体质量却比男性双胞胎大(Loosetal.，2001)，由此可见，胎儿孕龄影响其生长发育；而在妊娠期由于受光周期、哺乳刺激、营养或者激素等因素的影响，大熊猫胚胎在发育到胚泡阶段时暂时进入休眠状态并不立即着床，在这个时期，胚泡或者停止细胞分化与增长，以使其大小及内部细胞数量保持稳定，或者经历一个少量细胞发生分化的缓慢增长阶段，在子宫内漂浮游离较长一段时间，当环境适宜后，游离胚胎才开始在子宫内着床并分化形成胎儿(Hodgesetal.，1984；栾黎明等，2005；Zhangetal.，2009)，而大熊猫双胞胎的这种延迟着床现象比单胎更为明显，因此，虽然大熊猫胚胎表现出的妊娠期最短85 d，最长201 d(王海瑞等，2015)，但是胎儿在母兽体内检出到产仔的时间却只有20～25 d(Kerseyetal.，2016)。所以，在各种性别类型双胞胎总体发育一致和极短的子宫内发育时间的条件下，大熊猫幼仔可能还没有机会表达出雌雄个体间初生体质量的差异。

3.3 母兽孕期增重与大熊猫双胞胎幼仔初生体质量的关系

目前，关于孕期增重与婴儿初生体质量关系的报道常见于人类孕妇(李荔荔等，2014；陈亚红，葛丽亚，2016；毛亚飞等，2017)。一般认为孕妇自身的营养状况尤其是孕期的营养与胎儿的生长和婴儿初生体质量密切相关，而孕妇孕期增重则可以综合反映孕妇健康和营养状况；据报道，孕妇孕期增重与婴儿初生体质量呈正相关(李荔荔等，2014；毛亚飞等，2017)，是影响婴儿初生体质量的重要因素(陈亚红等，2016)，当孕妇孕期增重不足时，胎儿不仅可能无法达到其应有的生长潜力而小于胎龄出现胎儿生长受限的现象(施梦瑶等，2017)，而且还可能诱使胎儿早产(李荔荔等，2014)。在本研究中，大熊猫母兽孕期增重对幼仔的初生体质量无明显影响(P=0.257)，其原因可能是由于孕前期胚胎在子宫内主要完成细胞分化、器官发育和胎盘功能建立，孕中晚期胚胎完成器官发育和胎盘功能建立后，能量才主要用于骨骼、肌肉和脂肪的生长，实现胎儿体质量快速增加(陈亚红，葛丽亚，2016)，但是大熊猫胚胎发育不仅有延迟着床现象，而且胎儿在子宫内生长期不足1个月，所以大熊猫幼仔胚胎期物质快速积累的时间极短，母兽孕期增重对其物质积累影响有限。

3.4 双胞胎个体性别和幼仔初生体质量对大熊猫幼仔1～12月龄体质量的影响

大熊猫双胞胎个体性别和幼仔初生体质量与幼仔生长发育之间关系的报道较多。刘定震等(2002)和褚青坡等(2019)报道认为雄性大熊猫个体初生体质量大于雌性，由于大熊猫属于典型的晚成性哺乳动物，初生幼仔裸露无毛，双眼未睁，无听觉能力，极为弱小，对母兽的依赖性强，除了由母兽负责安全、保暖和清洁卫生，主要靠从母乳中获取营养，因而初生幼仔对母乳的获取能力、母兽的营养状况和哺育能力成为决定幼仔生长发育的主要因素，而雄性个体的初生体质量较大，在成长过程中竞争力更强、生长速率更快。通过对家畜初生体质量和性别对其生长发育的影响，发现荷斯坦奶牛12月龄体质量、萨福克羊6月龄体质量和仔猪20日龄及60日龄体质量与其初生体质量相关(曹进夫，1999；邓勇等，2000；顾亚玲等，2008)，并认为雄性个体生长发育快，异化作用强，在营养丰富条件下的体质量比雌性大。在本研究中，大熊猫幼仔在1～12月龄期间，初生体质量较大个体与较小个体的生长发育并未表现出有统计学意义的差异(P>0.05)，并且不同性别大熊猫幼仔的体质量增长与张和民等(2003)和李明喜(2004)的报道一致，其原因可能是刘定震等(2002)和褚青坡等(2019)报道的大熊猫幼仔采用的是母兽直接哺育，因而在大熊猫双胞胎幼仔生长发育早期，初生体质量较大个体的活动能力较大，母乳获取能力更强，生长发育更快；而初生体质量过小的幼仔往往无力寻找母兽的乳头和吮吸乳汁而导致生长发育受限。本研究中的大熊猫幼仔不仅初生体质量在性别间无差异而且在生长发育早期皆采用人工辅助育幼，从而避免了体弱个体难以与体强个体竞争的问题，而且当幼仔在母兽处吃母乳时，人工将幼仔移至母兽乳头处，让幼仔吸乳，并设法让母兽不将幼仔移开(黄祥明等，2005)，也避免了体弱个体找不到乳头的问题，确保了大熊猫双胞胎幼仔都获得充足的初乳和母乳，因此，大熊猫幼仔在1～12月龄期间，人工辅助育幼可能降低了不同初生体质量对其生长发育的影响。虽然成年雄性大熊猫体质量略大于成年雌性(冯文和，张安居，1988)，但在1～12月龄的生长发育中未能表现出性别间的差异，可能是人工辅助育幼延迟了其性别效应。