2013-2018年北京市志贺菌药物敏感性状况研究

吕冰 田祎 张新 黄瑛 王全意 曲梅

细菌性痢疾是由志贺菌属病原菌感染引起的一种常见肠道传染病，志贺菌对人群普遍易感，严重影响人类健康。在发展中国家，菌痢是五岁以下儿童死亡的重要原因之一[1]。2005年8月，卫生部发布《全国细菌性痢疾监测方案(试行)》，依据该方案，北京市将志贺菌监测纳入常规监测范畴。十余年的监测结果显示，宋内志贺菌已经成为北京市痢疾病原菌的优势菌株[2]，并且其耐药率一直处于较高水平[3]。本研究收集了2013-2018年痢疾监测工作中分离到的志贺菌，进行药物敏感性试验，确定是否为产超广谱β内酰胺酶(extended spectrum β-lactamases，ESBLs) 菌株，并且对ESBLs菌株进行PCR扩增，检测其耐药相关基因位点，了解北京市近2013-2018年志贺菌药物敏感性流行情况。

1 材料与方法

1.1菌株来源 根据《国家霍乱痢疾监测方案北京实施办法》以及《北京市痢疾及其它感染性腹泻监测与疫情处置工作方案》，北京市16区均为监测点，每个监测点选取1～2家有一定工作基础的医院作为监测医院肠道门诊，每年4-10月每月完成40份病人粪便样本的检测，其他月份完成10～20份粪便标本的检测，并上送分离到的病原菌，由各区疾控中心进行鉴定，菌株鉴定标准依据依据国家诊断标准《细菌性和阿米巴性痢疾诊断标准WS287-2008 附录A》，鉴定血清为日本生研志贺菌鉴定血清。

1.2药物敏感性试验 药敏试验根据美国临床与实验室标准委员会(Clinical and Laborary Standards Institute, CLSI)推荐的最小抑菌浓度法(minimal inhibitory concentration, MIC)。药敏试验应用上海星佰生物技术有限公司提供的革兰阴性需氧菌药敏检测板，应用的药物有：环丙沙星、氨苄西林、氯霉素、磺胺异恶唑、复方新诺明、萘啶酸、阿莫西林-克拉维甲酸、头孢曲松、庆大霉素、四环素、头孢西丁、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、亚胺培南、头孢噻肟-克拉维酸、头孢他啶-克拉维酸。其结果与CLSI推荐的《抗菌药物敏感性试验执行标准：第26版》比较，以大肠埃希菌ATCC25922作为质控菌株。

1.3产ESBLs菌株的表型确证实验 参照CLSI推荐的头孢噻肟、头孢噻肟-克拉维酸、头孢他啶、头孢他啶-克拉维酸MIC法的确证实验鉴定产ESBLs的志贺菌。与克拉维酸联合的药物MIC相对单独药物的MIC减低≥3个倍比稀释度，即确定为产ESBLs菌株。

1.4产ESBLs相关基因位点检测及基因型分析 采用裂解法提取志贺菌DNA作为模板，参照文献合成TEM型、SHV型、OXA型、CTXM型的ESBLs编码基因特异性引物，引物序列见表1,引物序列来自于参考文献[4-6]。PCR反应体系为25 μL，包括双蒸水9 μL、2×缓冲液12.5 μL、10 μmol/L引物各0.5 μL、DNA模板2 μL。PCR反应试剂均购自北京擎科新业生物有限公司，由北京擎科新业生物技术有限公司完成PCR产物的测序，测序结果在NCBI提供的数据库中比对。

1.5统计学方法 应用SPSS 20.0分析菌株耐药结果以及耐药相关基因携带率等。

表1 产超广谱β-内酰胺酶相关基因引物合成序列

2 结果

2.1菌株血清分型鉴定结果 2013-2018年，共收集266株志贺菌，其中,2013年72株，2014年96株，2015年66株，2016年24株，2017年6株，2018年2株。266株志贺菌中宋内志贺菌207株，占77.8%,福氏志贺菌56株，占21.05%，鲍氏志贺菌1株(鲍氏4型),痢疾志贺菌2株(痢疾志贺菌2型和9型)。所有宋内菌中宋内I型181株，宋内II型26株。福氏志贺菌株的分型情况如下：F1a 6株，F2a 36株，F1b 1株，F2b 4株，F4 2株，F4c 2株，Fx 1株，Fx变种2株，Fy 1株，Fy变种1株。

2.2药物敏感性检测结果 志贺菌对氨苄西林、复方新诺明和萘啶酸三种药物的耐药率已经超过90%，头孢类药物如头孢西丁、头孢吡肟、头孢他啶以及环丙沙星的耐药率低于20%，266株志贺菌全部敏感的药物为亚胺培南。福氏志贺菌对环丙沙星、氯霉素和阿莫西林-克拉维甲酸的耐药率较宋内志贺菌高，宋内志贺菌对磺胺异恶唑、复方新诺明和庆大霉素的耐药率较福氏志贺菌高 (表2)。

2.3产ESBLs菌株确证实验 按照CLSI推荐的头孢噻肟、头孢噻肟-克拉维酸、头孢他啶、头孢他啶-克拉维酸MIC法的确证实验，266株志贺菌中，95株志贺菌确证为产ESBL菌株。其中,19株为福氏志贺菌，76株为宋内志贺菌。

2.4耐药相关基因检测 通过PCR方法检测耐药相关基因，结果显示：95株21株检出TEM基因(22.1%，21/95)，18株检出OXA基因(18.95%，18/95)，75株检出CTXM基因(78.95%，75/95)；75株CTXM阳性PCR产物经序列比对发现有1株CTXM3型；21株CTXM14型；53株CTXM15型。分析三种耐药基因2013-2018年在产ESBLs菌株中的携带率，发现CTXM基因携带率一直处于较高水平，除2017年外，OXA和TEM基因的携带率一直较低(图1)。

图1 北京市2013-2018年产ESBLs志贺菌的三种耐药相关基因携带率

3 讨论

3.12008年以后，宋内志贺菌已取代福氏志贺菌成为北京地区优势菌型[2]。监测表明，2013-2018年宋内志贺菌株依然是北京市优势菌株，并且志贺菌的耐药情况日益突出。北京市志贺菌对氨苄西林、复方新诺明和萘啶酸三种药物的耐药率较高，临床常用的头孢曲松和头孢噻肟的耐药率也达到了40%以上，这个结果应与临床上常用这两种药物有关，其他学者也得到了相近的研究结果[7]。志贺菌对头孢西丁、头孢吡肟、头孢他啶以及环丙沙星药物的耐药率比较低，可考虑用于临床，但环丙沙星对于福氏志贺菌耐药率较高，临床应用中应予以关注。

表2 2013-2018年 北京市266株志贺菌药物敏感性检测结果

注：*为Fisher概率法计算得出的P值。

3.2研究结果显示，266株志贺菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)确证试验，有95株志贺菌为产ESBLs菌株。ESBLs指能分解青霉素类、头孢菌素类及氨曲南等β-内酰胺类抗生素的酶，其能够使细菌对这类药物产生耐药性而导致治疗失败[8,9]，因此，明确细菌是否产生ESBLs具有重要的临床意义。对ESBLs特异相关基因的测序结果显示，北京地区产ESBLs宋内志贺氏菌以携带CTXM基因为主，主要为CTXM15型，其次为TEM型。以往的研究中，鲍春梅等[10]也得出相似结论，认为北京市产ESBLs志贺菌株以CTXM型为主；浙江省和安徽省也报道检出CTXM15型和CTXM14型ESBLs[11,12]。本研究发现CTXM基因2017年携带率出现降低，可能是由于该年份菌株量过少引起的异常结果。CTXM基因多由可接合的质粒携带，更易于通过质粒的水平转移方式传播，所以对CTXM型ESBLS菌株的长期监测具有很高的公共卫生学意义，需要在日常工作中持续开展。