茶树谷胱甘肽过氧化物酶编码基因CsGPX1功能分析

刘赛，刘硕谦,3，龙金花，吴敦超，陈宇宏，刘丽萍，刘仲华,3，田娜,3*

茶树谷胱甘肽过氧化物酶编码基因功能分析

刘赛1,2，刘硕谦1,2,3，龙金花1,2，吴敦超1,2，陈宇宏1,2，刘丽萍1,2，刘仲华1,2,3，田娜1,2,3*

1. 湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2. 国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；3. 教育部茶学重点实验室，湖南 长沙 410128

为明确茶树[(L.) O. Kuntze.]谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidases，GPX）编码基因的功能，本文利用茶树转录组数据克隆获得的编码区全长序列，进行序列比对与分析，在此基础上，将在烟草中进行过表达获得转基因烟草，并比较野生型烟草与转基因烟草耐旱性的差异，验证功能。序列分析表明，编码序列（CDS）长723 bp，编码240个氨基酸。BLAST比对发现，该基因与桃树（）的基因具有高度同源性（>85%）。编码的氨基酸序列具有GPX蛋白保守特征序列和区别于其他家族成员的特有的结构域——磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（PHGPX）。干旱胁迫处理结果显示，过表达烟草株系抗旱性强于野生型。GPX酶活性测定结果表明，转基因植株的GPX酶活性高于野生型植株。以上研究结果表明，过表达可提高转基因烟草的耐旱能力，说明可能与茶树的耐旱性能相关。本研究为提高茶树的耐旱性能研究提供了新的理论途径，并对降低茶园管理的成本具有一定的积极意义。

茶树；谷胱甘肽；过氧化物酶；非生物胁迫；抗旱机理

植物在正常的新陈代谢过程中，在体内会不断产生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）。而在低温、盐碱、干旱等逆境胁迫时，植物体内ROS含量会迅速上升。若植物体内的ROS上升到一定程度，将会使植物受到伤害[1]，严重时会导致植物死亡。为应对逆境产生的氧化胁迫，植物细胞存在两种机制，即非酶促反应与酶促反应[1]，来平衡ROS的正常水平，减少ROS造成的损伤。酶促抗氧化系统中，抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidases，GPX）、过氧化物酶（Peroxidases，POD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）等在保护植物细胞免受氧化损伤过程中扮演重要的角色[2]。

GPX是生物机体内重要的抗氧化酶，它通过清除机体内的活性氧自由基，使活性氧自由基对机体的损伤被阻断，使细胞免受氧化胁迫，从而增强植物的抗逆能力。GPX能调节植物胁迫适应性，可以作为信号分子，与激素交联，参与植物的生长发育[2]。已有研究表明，植物GPX是一个包含多种同工酶的家族，其中磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase，PHGPX）属于家族中的独特成员，KWNF（E/T/A/S）KFLV是PHGPX区别于其他家族成员的特有的结构域。PHGPX具有特异性地还原膜上磷脂氢过氧化物的功能，其参与细胞凋亡信号调控，可以保护DNA、磷脂、胆固醇等[3]。因此，通常认为合成GPX酶的相关基因是非常重要的抗逆相关基因。所以研究这些基因的功能对进一步理解植物抗逆机理，以及抗逆基因工程的改良等都具有重要意义。

植物体内基因最初从烟草中克隆出来，之后又有学者相继从拟南芥[4]、水稻[5]、番茄[6]、柑橘[7]、菠菜[8]、盐芥[3]等植物中克隆和鉴定了植物基因。肖蓉等[1]研究发现，在植物干旱和盐胁迫时，枣树基因在其胁迫反应机制中发挥重要作用，过量表达基因有助于提高转基因拟南芥的耐旱、耐盐能力。王菲菲等[9]研究发现，过量表达胡杨基因可显著提高烟草的耐盐性。陈义挺[10]研究表明，GPX活性变化与龙眼胚性细胞抗逆性具有正相关关系，其活性变化可作为植物在逆境胁迫下减轻ROS伤害的重要标志之一。

茶树[(L.) O. Kuntze.]是我国一种古老而重要的经济作物，其的研究报道尚少。乔新荣等[11]研究发现茶树基因在干旱胁迫反应中发挥着重要作用，但对在茶树抗逆方面分子机理的研究还不够深入。随着目前分子技术的迅速发展，通过分子技术育种已然是一种行之有效的途径，选择培育抗逆性强的茶树良种意义重大[12]。并且通过基因工程提高作物的抗逆性是目前作物遗传转化研究的热点，所以本研究将对于指导培育茶树抗逆新品种具有重要意义。

本课题组前期比较转录组学研究发现，干旱处理的茶树中基因表达水平急剧升高（数据未发表），为此我们推测可能具有抗旱的功能。为进一步验证的功能，本研究利用茶树转录组数据获得了编码区全长序列，并对该序列进行生物信息学分析，预测其功能。在此基础之上，构建了植物表达载体，运用农杆菌介导法，将转入烟草，而后不断自交直至获得T3代种子，以此为材料进行干旱胁迫试验，并进行GPX酶的活性测定，深入分析该基因的功能。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料与培养条件

本试验所用的茶树材料来自湖南农业大学校内茶园基地，采摘其芽头立即用液氮处理3 min，于–80℃超低温冰箱保存。烟草培养条件为室温(25±1)℃，12 h光照周期，相对湿度60%~80%。

1.2 化学试剂及试剂盒

试验所用的主要化学试剂均为分析纯，购于长沙试剂公司；pCXSN植物表达载体由美国俄亥俄大学王国梁教授构建[13]；谷胱甘肽过氧化物酶测试盒购自南京建成生物工程研究所；first-strand cDNA synthesis kit，Prime STAR HS DNA Polymerase，TaKaRa MiniBEST Agrose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0，DNA A-Tailing Kit和T4 DNA Ligase等购于Takara公司；Free DNase Set试剂盒购于Qiagen公司。

1.3 总RNA提取及反转录

根据Tri-Reagent试剂盒说明书提取总RNA，用Free DNase Set试剂盒去除DNA。用Nanodrop 2000检测总RNA浓度和质量。取1 μL RNA，通过凝胶电泳测定RNA样品的纯度及完整性。根据Takara cDNA第一链合成试剂盒，以茶树叶片RNA为模板，逆转录合成cDNA第一链。

1.4 CsGPX1基因扩增

根据基因的cDNA序列使用Primer 5软件设计引物扩增ORF序列，引物由上海生物工程技术有限公司合成。用Prime STAR HS DNA Polymerase进行PCR扩增。扩增引物：上游引物GPXOF：5'-ATGGCTTCTTCCTCTTCA-3'；下游引物GPXOR：5'-AAACTCGTTGCAGCA-3'。扩增程序为：98℃变性10 s，55℃退火5 min，72℃延伸1.5 min，循环30次。

1.5 CsGPX1的生物信息学分析

采用Clustal W软件进行序列比对，采用DNAMAN和BioEdit软件进行ORF（Open reading frame）翻译、蛋白质基本性质等分析，GenBank BLAST和蛋白质序列的CDD搜索在NCBI网站上进行，运用ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam）在线预测氨基酸的组成与理化性质。

1.6 CsGPX1植物过表达载体构建

利用TaKaRa切胶回收试剂盒回收目的片段，并连接A尾，将加了A尾的基因片段与XcmI酶切后的pCXSN质粒用T4连接酶进行连接反应。连接体系具体如下：载体片段：50~60 ng，目的片段：150 ng，T4-DNA Ligase：0.5 μL，T4-DNA Ligase Buffer：2 μL，ddH2O定容至20 μL。16℃下连接过夜，连接产物用热激法转化大肠杆菌感受态DH5。通过菌落PCR验证，阳性菌落进一步送至上海生物工程技术有限公司测序验证。测序验证正确的菌落，通过液体培养并提取质粒，测序验证。

1.7 CsGPX1过表达载体的烟草转化

用冻融法将重组质粒pCXSN-CsGPX1转入农杆菌GV3101中[14]，然后通过农杆菌介导将重组质粒pCXSN-CsGPX1采用叶盘法转化烟草[15]。侵染后的外植体置于1/2MS固态培养基上进行共培养，诱导不定芽的生成（培养基含1/2MS+1 mg·L-16-BA+0.15 mg·L-1NAA +400 mg·L-1头孢霉素+60 mg·L-1潮霉素）。待长出抗性芽后，进行生根诱导培养（培养基含1/2MS+0.15 mg·L-1NAA+400 mg·L-1头孢霉素+15 mg·L-1潮霉素）。生根一周后移栽至营养土中培养。

1.8 转基因烟草的鉴定及纯化

用CTAB法[16]提取转基因烟草基因组DNA，PCR法验证目的基因是否成功转入烟草。阳性烟草植株进行自交，获得T0代种子，灭菌后均匀撒在含有60 mg·L-1潮霉素的1/2MS筛选培养基上，待烟草长出两片真叶后转入营养土中进行培养，并采用PCR进行验证，收集PCR阳性结果的烟草种子，重复上述筛选方法，直至得到转基因烟草纯合体（T3代）。

1.9 CsGPX1过表达植株抗旱试验

将野生型烟草（WT）和转基因烟草植株的T3代种子（分为O1、O2、O3三组）均匀撒在垫有润湿滤纸的玻璃培养皿中，于25℃培养。待烟草长出两片真叶时，移栽至营养土中继续培养，每组8株，共32株。待长势稳定时，浇水至饱和，采用不浇水的处理开始进行干旱胁迫。待所有株系都表现出叶片黄化、萎蔫时，加水至饱和状态。如此重复操作，使烟草处于干旱环境。观察烟草恢复活性的情况，并拍照记录。

1.10 过表达CsGPX1烟草植株生理生化指标测定

生理生化指标测定参照李合生的方法[17]，谷胱甘肽过氧化物酶活性用谷胱甘肽过氧化物酶测试盒测定。

1.11 数据分析

采用Excel 2010、SPSS 23.0、Origin 2017进行数据分析。干旱胁迫处理结果使用T检验分析统计学显著性差异；GPX酶活测定结果使用单因素方差分析方法分析。

2 结果与分析

2.1 CsGPX1基因克隆

根据转录组序列设计引物，PCR扩增获得目的基因。序列分析表明，该基因含有1个长度为723 bp的ORF，编码240个氨基酸（图1）。

图1 CsGPX1的核苷酸序列和氨基酸序列

2.2 蛋白序列的同源性分析及系统发育分析

为了预测基因的功能，采用NCBI BLASTP进行序列同源性分析，并用MEGA 4.1将该基因的氨基酸序列与其他物种的GPX氨基酸序列比对分析，结果如图2所示。编码的氨基酸序列具有GPX蛋白保守特征序列——3个保守结构域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）：VNVAS（K/R/Q/E）CGLT，LAFPCNQF和KWNF（E/T/A/S）KFLV，并且KWNF（E/T/A/S）KFLV是区别于其他家族成员的PHGPX特有的结构域；GPX同工酶含有3个保守半胱氨酸（C）残基催化位点，其中前两个分别位于第Ⅰ、第Ⅱ结构域内，第3个位于结构域外（图2的黑三角）[2-3]。由编码的氨基酸序列与其他植物GPX氨基酸序列系统进化树（图3）可知，编码的氨基酸序列与月季（、XP_024162855.1）、桃树（、XP_007223774.1）和欧洲甜樱桃木（、XP_021821043.1）的GPX氨基酸序列的亲缘关系比较近。

2.3 编码蛋白质结构分析

运用ProtParam tool在线预测CsGPX1蛋白的氨基酸组成与理化性质，结果显示，CsGPX1的预测分子式为C1205H1844N306O349S6，分子量为26.394 1 kD，理论等电点（pI）为9.31，负电荷残基Asp和Glu分别为9个和10个，正电荷残基Arg和Lys分别为4个和24个。

注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区域表示GPX的保守结构域；▼表示GPX酶的活性中心残基。CoGPX：长蒴黄麻，OMO90689.1；PpGPX1：桃树，XP 007223774.1；JcGPX1：麻风树，NP 001292953.1；PeGPX1：胡杨树，NP 001306722.1；QsGPX1：栓皮栎，XP 023923965.1；RcGPX1：月季，XP 024162855.1

注：M：Trans 100 bp Plus II DNA Ladder，P：CsGPX1基因

2.4 CsGPX1过表达载体检测

以茶树叶片的cDNA作为模板，在高保真酶的作用下，通过特异性引物扩增出了基因，目的基因的片段大小在750 bp左右（图4），扩增产物为明亮、单一条带，符合预测结果。用XcmI酶对pCXSN质粒进行酶切，将长片段切胶回收，利用T4连接酶与目的片段进行连接，获得过表达载体pCXSN-CsGPX1。通过热激法将重组质粒转入大肠杆菌DH5，挑选单一菌落，菌落PCR验证采用特异性引物对（GPXOF/CXSNOF）进行，挑取阳性克隆进行测序，测序结果表明pCXSN-CsGPX1载体序列正确。

2.5 过表达CsGPX1烟草植株筛选与验证

用CXSNOF/CXSNOR引物进行验证pCXSN-CsGPX1载体转化农杆菌GV3101是否成功。2~6的泳道中（图5）均为明显单一的条带，用质粒转化农杆菌的泳道7中没有条带，结果表明过表达载体pCXSN-CsGPX1已经成功导入农杆菌GV3101中。

以野生型烟草的总DNA为对照，以转基因烟草的总DNA为模板，通过特异性引物对（GPXOF/CXSNOF）进行PCR检测。1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，野生型烟草泳道（2）无特异性条带，而转基因烟草泳道（3~8）（图6）出现明亮、单一的特异性条带，大小在750 bp左右，结果完全符合试验预期，由此说明基因已经成功导入烟草中，即成功得到了转基因阳性植株。

注：M：100 bp Plus II DNA Ladder，P：基因

Note: M:100 bp Plus II DNA Ladder. P:Gene

图4基因PCR 扩增电泳

Fig. 4 The electrophoresis analysis of PCR amplification production of

2.6 过表达CsGPX1烟草植株抗性结果分析

在野生型和转基因烟草苗成株期进行干旱胁迫后，如图7-A结果所示，野生烟草植株开始表现出叶片黄化、萎蔫，而转基因烟草株系生长基本正常。且野生型烟草植株与转基因株系相比，其植株矮小。干旱胁迫进行到如图7-B时，所有株系都表现出叶片黄化、萎蔫。此时，给所有植株浇水至饱和。结果如图7-C所示，转基因烟草株系87.5%恢复活性，而野生型烟草株系只有12.5%恢复活性。过表达烟草植株（O1—O3）和野生型烟草植株（WT）经干旱胁迫后恢复活性植株的数量统计如图8所示，与对照组相比，转基因组植株复活数量具有极显著性差异（<0.01）。由上可证明过表达烟草耐旱性明显提高。

注：1：Trans 100bp Plus II DNA Ladder；2~6：重组质粒转化农杆菌GV3101；7：用质粒转化的农杆菌

注：1：Trans 100bp Plus II DNA Ladder；2：野生型烟草DNA；3~8：转基因烟草DNA

注：A：叶片开始萎蔫；B：叶片全部萎蔫；C：叶片恢复活性

注：使用T检验分析统计学显著性差异（**：同WT组比较，差异极显著，P＜0.01）

2.7 过表达CsGPX1烟草植株GPX活性测定结果与分析

对过表达烟草植株的GPX酶活性进行测定，结果如图9所示。从图中可以看出3组转基因株系O1—O3的GPX活性都高于野生型株系WT；其中转基因株系O1的酶活性最高，达野生型株系WT的4.4倍，统计分析结果表明具有极显著性差异（<0.01）。

3 讨论

植物GPX是一个包含有多种同工酶的家族，这些同工酶在酶学特点、一级结构、亚基结构和亚细胞定位上显著不同，但都具有高度保守区域[18]。研究表明，GPX在植物体内可能具有多个家族成员，在不同的环境条件、树种、组织里每个家族成员可能表现出不同的表达水平和表达模式[8]。有研究发现在拟南芥中存在8个GPX酶的基因序列（AtGPX1—AtGPX8）[19-20]。本研究克隆并获得了茶树基因，通过蛋白序列的同源性分析及系统发育分析发现，其所编码的氨基酸序列具有植物GPX的3个特征保守结构域，并且具有区别于其他家族成员的PHGPX特有的结构域，同时也含有GPX活性中心的3个保守的半胱氨酸残基，因此，本研究所克隆的基因编码的蛋白属于植物GPX家族成员。

注：**同WT组比较：P＜0.01差异极显著

有研究[21]发现，在受到机械损伤胁迫时，过表达的转基因植物比对照组受到的影响小；而当受到病菌感染时，与对照相比，过表达的转基因植物的坏死病灶更显著增加。该研究表明，当植物受到非生物胁迫时，过表达减缓了非生物胁迫给植物带来的伤害；然而，当植物受到生物胁迫时，过量表达抵消了植物自身的防御反应并增加了植株死亡的发生[21]。本研究对获取的转基因烟草株系进行干旱胁迫处理，结果显示，过表达株系具有良好的耐旱性。这对于进一步探索基因以及茶树GPX家族的生物学功能、非生物抗性机理与茶树抗逆基因改良工程中的利用具有重大意义。

GPX是抗氧化酶体系中的重要成员，可催化谷胱甘肽（GSH）转化为氧化型谷胱甘肽（GSSG），将有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时也可以促进H2O2的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不遭受损害[22]。有研究发现，茶树的抗性与体内可溶性糖含量有关，并且可溶性糖含量增加可引发一系列的生理代谢反应，在一定程度上，随着可溶性糖的含量增加，植株对环境的适应能力增强[23]。植物的光合作用对逆境反应敏感，光合作用的强弱对于植物生长、产量都有重要影响[24]。过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）是植物抗氧化防御系统中最重要的保护酶，是以铁卟啉为辅基的酶类[25-26]。CAT和POD可以将活性氧分解为氧气和水，从而减少体内的活性氧积累，使植物免受其毒害。

本研究也对过表达基因的烟草进行了与抗逆相关生理生化检测，包括其可溶性糖含量、光合速率、CAT酶活性、POD酶活性及GPX酶活性的测定。结果表明，转基因烟草的这些生理生化指标测定结果都高于野生型烟草；但可溶性糖含量、光合速率、CAT酶活性、POD酶活性的测定结果没有显著性差异，而GPX酶活性的测定结果表明，转基因株系O1的酶活性最高，是野生型株系WT的4.4倍，具有极显著性差异（<0.01）。但是，抗性试验数据（图8）与酶活性试验数据（图9）表现趋势并不完全一致，我们推测出现这种情况可能是因为本试验中转基因烟草除了本身所含内源GPX酶之外还含有通过转基因获得的CsGPX1酶，而CsGPX1酶在转基因烟草中稳定存在，可能是使转基因烟草抗旱性能提高的主要原因，但是内源仅仅在干旱胁迫之后诱导表达，且内源基因表达时期存在个体差异，因此有些样品检测到的是内源基因表达高峰期，有些样品检测到的是表达低峰期，导致酶活性测定数据与抗旱结果不能完全一一对应，但具体机制需进一步研究。综上所述，我们可以进一步推断，基因的转入增强了烟草的非生物抗性，说明基因具有提高茶树非生物抗性的功能。但是，在非生物逆境下的具体机制，尚需更进一步的研究探索。

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Functional Analysis of Glutathione Peroxidase Encoding Genein

LIU Sai1,2，LIU Shuoqian1,2,3，LONG Jinhua1,2，WU Dunchao1,2，CHEN Yuhong1,2，LIU Liping1,2，LIU Zhonghua1,2,3，TIAN Na1,2,3*

1. College of Horticulture and Hardening, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China; 3. Key Lab of Tea Science, Ministry of Education, Changsha 410128, China.

To clarify function of glutathione peroxidase-encoding genein(L.) O. Kuntze, the full-length sequence of the coding region ofwas obtained by transcriptome data of tea plant, and sequence analysis and function prediction were performed. Then, thewas overexpressed in tobacco. Subsequently, the difference in drought tolerance between wild-type and transgenic tobacco was compared to verify the function of. Sequence analysis indicates thatwas 723 bp in length, encoding 240 amino acids. The Blast alignment reveals that theshowed more than 85% of identity in amino acid withfrom. The amino acid sequence encoded byhas a conserved characteristic sequence of the GPX protein and a phospholipid hydrogen glutathione peroxidase (PHGPX) which is unique to other family members. The results of drought stress treatment show that the drought resistance of the over-expressing ofin tobacco lines was stronger than that of wild-type. The results of GPX enzyme activity assay show that the GPX enzyme activity of the transgenic plants was higher than that of the wild type plants. All of above results verify that the over-expression ofimproved the drought tolerance of transgenic tobacco, suggesting thatmight be related to the drought resistance in tea plants. This study could provide a new strategy to improve the drought resistance of tea plants, which would significantly reduce the management cost of tea plantation.

, glutathione, peroxidase, abiotic stress, drought resistance mechanism

S571.1；Q52

A

1000-369X(2019)04-382-10

2019-03-08

2019-04-15

国家自然科学基金（31670689）、湖南省重点研发计划（2018NK2032）

刘赛，女，硕士研究生，主要从事茶树分子生物学方面的研究，liusai0417@foxmail.com。 *通信作者：tianna5678@163.com