6种进口猪精液常温保存稀释粉的效果比较

徐小波　严敏　欧正铨　任宪路　师蔚群

摘要：为了解进口猪精液常温保存稀释粉的实际应用效果，选购市场上常见的6种进口稀释粉进行比较试验。结果表明：随着常温保存时间的延长，不同稀释粉组间，活力下降速度存在差异，其中DILTEC和CXM下降最快，PRIMXCELL组下降最慢。精子有效存活时间差异很大，由长到短的顺序为PRIMXCELL>ACTIYE>XINZUAN>SpermPro>CXM>DILTEC;总存活时间也是PRIMXCELL最长，达到384 h以上;保存120 h顶体完整率存在显著差异，从高到低顺序为PRIMXCELL>SpermPro>XINZUAN>ACTIYE>CXM>DILTEC。说明法国的PRIMXCELL稀释粉最好，有效存活时间242 h，总存活时间384 408 h，保存120 h顶体完整率79.6%。

关键词：公猪精液;稀释粉;常温保存;精子活力;顶体完整率

中图分类号： S814.3;S828.3+4文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）09-0201-03

1956年英国学者Polge成功地将猪人工授精技术从试验研究应用于养猪生产实践，但直到20世纪80年代这项技术才真正在养猪生产中广泛应用[1]。我国猪人工授精推广较晚，且外种猪引进（造成发情鉴定不准确）等原因严重影响了本项技术的发展。一些养猪发达国家人工授精的普及率在90%以上[2-3]，我国猪人工授精的比例在40%左右，规模猪场的比例达85%。虽然猪冷冻精液能实现猪精液的长期保存，但其技术相对复杂、成本高且受胎率低，所以99%以上采用常温保存精液来实施猪人工授精[4]。猪精液的活力保存是人工授精的重要环节，其中稀释粉的配制是保证精子质量的关键因素之一。国外稀释粉研究较早，保存效果相对较好，目前常见的进口稀释粉有丹麦的亚卫、比利时的CMX、美国的VIM、西班牙BIO、法国卡苏BTS等，进口稀释粉种类多，价格贵，效果差别较大。为筛选出优秀的进口稀释粉，本研究挑选出市售常见的6种进口稀释粉进行效果比较，以期为猪人工授精的推广应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 稀释粉

选购市场上常见的6种进口稀释粉（法国PRIMXCELL、荷兰SpermPro、丹麦ACTIYE、西班牙DILTEC、比利时CXM和韩国XINZUAN）进行比较试验。

1.2 公猪精液

试验用精液來源于徐州惠牧种畜禽有限公司18月龄的健康大约克种猪，于2017年5月共4次采集同一头公猪精液（公猪号HM15385），手握法采精，收集中段精子含量高的部分（丢弃射精开始与结束时精清含量高的部分）精液，每次采精结束10 min内用猪精子质量计算机检测系统检测原精密度与活力（表1），平均分成6份，准备稀释。

1.3 精液的稀释和保存

在精液稀释前1 h，将6种不同的稀释粉按说明书分别用双蒸水配制成稀释液，置于37 ℃恒温水浴中预热备用。采集的新鲜精液检查合格后30 min内完成稀释，根据精液密度确定稀释倍数（稀释终密度为3.5×107个/mL），保证80～100 mL 稀释精液中含有效精子数30×108个左右。稀释前将稀释液的温度调至与精液温度之差小于1 ℃，将稀释好的精液分装在10 mL青霉素瓶中做好6种不同标记并编号，用多层毛巾覆盖在室温中缓慢降温，3～4 h后置于17 ℃的恒温箱中保存。保存过程中每隔12 h轻轻翻动1次，防止精子在瓶底沉淀时间过长，影响活力保存。

1.4 精子活力检查

每隔24 h，从6种稀释精液中各取出1瓶轻轻摇匀后置于37 ℃水浴中预热2 min，取中层精液10 μL涂片，用猪精子质量计算机检测系统检测精子活力变化。

1.5 顶体完整率

于稀释后保存120 h，使用南京建成精子快速染色试剂盒按程序对精子进行涂片染色，在1 000倍光学显微镜下观察统计顶体完整率（即顶体完整的精子所占总精子的比例）。

1.6 数据处理

精子活力及顶体完整率检测均采用多视野（3个以上）平均值，用“平均值±标准差”表示，用SPSS 18.0进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同猪精液稀释粉在稀释过程中对精子活力的影响

6种稀释粉稀释后的精液，精子活力均有所下降（表2），其中西班牙的DILTEC和比利时的CXM下降幅度较大（P<0.05），其次是法国的PRIMXCELL和丹麦的ACTIYE（P<0.05），荷兰的SpermPro下降幅度较小（P<0.05），韩国的XINZUAN下降最小（P<0.05）。说明不同的稀释粉，在稀释过程中对精子的应激损伤程度有差异。

2.2 不同猪精液稀释粉对精子常温保存过程中活力的影响

随着常温保存时间的延长，精子活力呈现逐步下降（表3），但不同稀释粉组间，下降速度存在差异，其中DILTEC和CXM下降较快，PRIMXCELL下降最慢，ACTIYE、SpermPro和XINZUAN下降速度居中且总速度相近，但ACTIYE表现为前期（120 h前）下降速度较快（3组下降速度依次为每天2.56、2.00和2.37百分点），后期（120～360 h）下降速度较慢（3组下降速度依次为每天6.15、6.42、6.89百分点）。

2.3 不同精液稀释粉对精子有效存活时间、总存活时间和顶体完整率的影响

6种稀释粉组的有效存活时间（活力维持在60%以上的存活时间）在162～242 h差异很大，由长到短的顺序为PRIMXCELL>ACTIYE>XINZUAN>SpermPro>CXM>DILTEC，PRIMXCELL有效存活时间最长，DILTEC最短;活力在30%时的存活时间在273～353 h之间，由长到短的顺序为PRIMXCELL>ACTIYE>SpermPro>XINZUAN>CXM>DILTEC，其中ACTIYE、SpermPro和XINZUAN很接近，都在 338 h 左右;总存活时间也是PRIMXCELL最长，达到384 h以上，DILTEC最短，只有312 h以上。6种稀释粉组保存 120 h 顶体完整率存在显著差异，其中PRIMXCELL最高（79.6%），显著高于DILTEC最低（69.8%），从高到低顺序为PRIMXCELL>SpermPro>XINZUAN>ACTIYE>CXM>DILTEC（表4）。

3 讨论与结论

3.1 猪精液稀释粉及其添加物的作用

猪原精不进行适当稀释，在室温下放置十几小时就会全部失去活力，常温保存稀释液提供猪精子存活并保持受精能力所需的能量物质及适宜的环境（pH值和渗透压等），稀释液中不同的添加物具有不同的作用，葡萄糖提供能量维持渗透压，碳酸氢钠、Tris和柠檬酸钠提供酸碱环境，EDTA防止顶体反应，谷胱甘肽和褪黑激素保护质膜防止氧化损伤，海藻糖和蔗糖等对质膜和顶体结构有保护作用，BSA作为蛋白保护剂则通过稳定精子结构等多途径保护精子，维生素C和氯丙嗪能抑制或降低精子的运动，这些添加物的适量使用与合理配合才能最大限度地延长稀释精液在常温保存的时间[5]。苏泽智等自制的稀释粉保存5 d的精子活力为63%，顶体完整率78.4%[6]，活力不同程度地低于本试验选的6种进口稀释粉，顶体完整率相当。尤如华等选用6种进口稀释粉与自配稀释粉进行比较，发现法国的PRIMXCELL活力保存时间最长，且自配与进口的在保存7 d活力差异不是很大，但之后活力差距迅速拉开[7]，由于其鲜精活力与本研究相比较低，所以保存相同时间的精子活力和总存活时间均低于本试验结果，但其比较与排序结果基本吻合。

3.2 精子活力、顶体完整率与受精能力

猪人工授精实践证明，猪一次正常输精量为80～100 mL，必须含有25×108个左右的精子，才能得到较高的受胎率。同时对精子活力的要求必须在60%以上，否则受胎率也会受到严重影响，所以保持60%精子活力的存活时间才是有意义的存活时间，并确定为有效存活时间。另外，精子的顶体含有多种与受精有关的酶，在顶体穿过透明带和放射冠中发挥重要作用，只有顶体完整、有活力的精子才具备受精能力，所以有些形态正常的精子虽然有活力但不具备受精能力，那是因为其顶体结构异常所致，同样一些顶体形态正常，但精子尾部丢失等精子整体形态不正常的精子则没有活力，也不具备受精能力，因此在对精液受精能力进行判定时，在活力检查的基础上结合顶体染色是很必要的[8]。本研究选择在常温下保存120 h在活力检测后进行顶体染色检查，结果显示所有稀释粉组精子活力都在64.9%以上，顶体完整率都在70%以上，说明6种稀释液虽然保存精子活力的时间有差异，但保存5 d都不会影响正常的受精。

3.3 研制高效国产稀释粉很有必要

目前养殖场使用较多的为进口稀释粉，虽然进口稀释粉价格较贵，但国产稀释粉保存时间短、受精效果差，所以人们宁愿选择较贵的稀释粉来保证較好的保存与受精质量，从而能在生产中得到较好的回报。因此，对好的进口稀释粉的成分进行研究，在国内已有稀释剂中添加各种利于精子活力保存的成分，以期研制出价格低、保存时间长、受精能力强的稀释粉，打破国人迷信进口稀释粉的状况，推动我国猪人工授精行业的快速发展。

参考文献：

[1]Johnson L A，Weitze K F，Fiser P，et al. Storage of boar semen[J]. Anim Reprod Sci，2000，62：143-172

[2]Gerrits R J，Lunney J K，Johnson L A，et al.Perspectives for artificial insemination and genomics to improve global swine populations[J]. Theriogenology，2005，63：283-99.

[3]Feitsma H. Artificial insemination in pigs，research and developments in the Netherlands，a review[J]. Acta Scientiae Veterinariae，2009，37（Suppl 1）：61-71.

[4]刘国世，王 剑，薛振华，等. 国外猪人工授精技术研究进展[J]. 猪业科学，2007（7）：16-19.

[5]张宝珣，戈 新，五建华，等. 猪常温精液保存的研究进展[J]. 猪业科学，2009（8）：68-71.

[6]苏泽智，李亚新，魏海燕，等. 稀释粉对猪精液常温保存效果的研究[J]. 家畜生态学报，2015，36（1）：59-62.

[7]尤如华，高春国，杨祖云，等. 不同稀释粉对公猪精液稀释保存效果的试验研究[J]. 养猪，2014（5）：47-48.

[8]王 锋. 动物繁殖学实验教程[M]. 北京：中国农业大学出版社，2006：44-47.